方法：1.将Walvax-2细胞分20代、25代、30代、35代至45代、50代和55代共16个代次,其中35代到45代之间均隔1代；2倒置显微镜下观察不同代次Walvax-2细胞显微结构及生长情况；3.透射电镜下观察不同代次Walvax-2细胞超微结构；4.以细胞衰老β-半乳糖苷酶染色法检测不同代次Walvax-2细胞β-半乳糖苷酶表达；5.以TRAP-PCR方法检测不同代次Walvax-2细胞端粒酶活性；6.绘制作生长曲线,观察不同代次Walvax-2细胞生长增殖能力；7.通过流式细胞仪检测不同代次Walvax-2细胞周期时相和细胞凋亡；8.Western印迹法检测不同代次Walvax-2细胞的P16基因和BMI-1基因的蛋白表达。
结果：1.倒置显微镜下：P20到P45生长状态良好且生长迅速,细胞为典型长梭状,为致密单层,紧密排列,呈编织状走行。胞内颗粒少,无空泡,膜清晰,符合二倍体成纤维细胞特性。P50细胞排列不规则,形状偏扁,体积缩小、颜色加深,边界不清,形态不规则,镜下可见少许圆缩细胞。P55贴壁生长的细胞散乱,细胞间空隙多,距离远,细胞间的接触消失,细胞圆缩数大量增加, 细胞内部结构不清楚,成批的细胞出现脱落,离壁飘起的现象。细胞可传58代,随细胞代次的增加,可见颜色逐渐加深,色素积累。2.透射电子显微镜观察到：P20到P43细胞体积均正常且骨架结构明显,细胞膜微绒毛均匀分布,核糖体丰富,细胞核完整,核膜光滑,具有较高的核质比。P44开始出现衰老现象,凋亡小体出现,内质网膜腔膨胀扩大,核糖体数量减少,细胞质色素积聚加深,有空泡形成,细胞中出现自噬体,细胞核形状不规则,核膜不同程度内折,核仁变小,内容物增多。P50和P55细胞衰老更加明显,大量细胞变形,体积增大,细胞膜完整性遭到破坏,细胞质色素积聚加深,微丝和微管崩解,可见大量空泡形成,内质网与线粒体崩解；自噬体数量增加,细胞核模糊不清。3.β-半乳糖苷酶检测显示：与初始代次年轻细胞P20(阳性细胞率13.42%)相比,衰老代次P55的阳性细胞率(37.72%)增强,Walvax-2人胚肺二倍体细胞趋向老化过程中β-半乳糖苷酶的阳性染色率逐代递增。β-半乳糖苷酶的阳性染色率和细胞代龄之间呈显著相关(P0.05)。4.端粒酶的检测结果分析显示：P20至P55端粒酶活性呈整体减少趋势,Walvax-2细胞端粒酶活性与代龄无显著性相关(P0.05)。5生长曲线分析显示：P50相比P20的生长速度明显减慢,P20的细胞活力明显强于P40(P0.05)和P50(P0.05),P30的细胞活力明显强于P40(P0.05)和P50(P0.05),P40的细胞活力明显强于P50(P0.05)。6流式细胞仪检测结果显示：不同代次G0/G1期百分比无变化,G2/M期同S期百分比随细胞代龄增长而降低,P55的S期细胞基本消失。检测到的细胞碎片随细胞代龄增长而增加,P55的细胞碎片达到36.83%。S期所占百分比与细胞代龄间的增长显著负相关(P0.05),G2/M期所占百分比与细胞代龄间的增长显著负相关(P0.05),细胞碎片所占百分比与细胞代龄间的增长显著正相关(P0.05)。7. Western印迹法检测结果显示：不同代次Walvax-2细胞的p16蛋白和BMI-1蛋白均未检测到表达。
结论：1、细胞形态学变化,β-半乳糖苷酶染色阳性率,流式细胞仪检测细胞周期中的S期、G2/M期和细胞碎片,细胞生长曲线均与Walvax-2细胞代龄增长显著相关。可选择作为Walvax-2细胞衰老程度评价的生物学指标。2、端粒酶活性与Walvax-2细胞代龄间的增长整体呈负相关趋势,但无统计学意义。是否适合作为Walvax-2细胞衰老评价生物学指标有待进一步研究。3、Walvax-2细胞中p16蛋白和BMI-1蛋白均未检测到表达,不适合作为Walvax-2细胞衰老评价生物学指标。
以人胚肺二倍体细胞Walvax-2细胞为研究对象,在细胞显微结构、超微结构、酶学变化、蛋白表达以及细胞生长等不同水平,通过检测不同代次人胚肺二倍体细胞衰老相关标记物,筛选出能够评价人胚肺二倍体细胞衰老程度的可靠生物学指标。
