一、组织分离与细胞获取（酶消化法）
取材与预处理
无菌条件下取出小鼠牙齿，迅速放入预冷的PBS或Hank’s液中清洗，去除血污和杂质。
用无菌眼科剪将牙髓组织剪成约1 mm³的微小碎块。
酶消化
使用胶原酶Ⅰ/Ⅱ（2–3 mg/mL）与中性蛋白酶（1–2 mg/mL）混合液，37℃孵育30–60分钟，间歇摇动以促进组织解离。
消化完成后，加入含10%胎牛血清（FBS）的完全培养基终止反应。
过滤与收集
将悬液经70 μm细胞滤膜过滤，去除未消化的组织块。
离心（300–400 g，5分钟）后弃上清，用完全培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶中。
培养条件：37℃、5% CO₂、饱和湿度，每2–3天换液一次，贴壁细胞约7–10天可形成集落。
二、细胞纯化（提高干细胞纯度）
免疫磁珠分选法（推荐）
使用特异性抗体标记干细胞表面标志物，如STRO-1、CD146、CD90。
将抗体与细胞孵育后，加入包被羊抗小鼠IgG或大鼠抗小鼠IgM的磁珠，4℃孵育40–60分钟。
利用Dynal MPC-1磁分离器分离阳性细胞，反复洗涤3次，获得高纯度牙髓干细胞。
流式细胞术分选（高精度）
荧光标记抗体（如CD90-FITC、CD146-PE）与细胞结合，通过流式细胞仪进行单细胞分选，纯度可达95%以上，但设备要求高。
低密度稀释克隆法（辅助手段）
将细胞稀释至极低密度（如1–5个/孔），培养14天后挑取单克隆进行扩增，确保遗传均一性。
三、质量控制
纯度检测：CD90免疫荧光鉴定阳性率≥90%。
无菌检测：确保无支原体、细菌、真菌污染。
功能验证：诱导成骨、成脂分化，确认多向分化潜能。
提示：原代细胞培养易受操作影响，建议在超净台内严格无菌操作，并添加ROCK抑制剂（如Y-27632）提升细胞贴壁率。
