一、第一次筛选：HAT培养基选择性培养
在细胞融合后，混合体系中存在未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、B-B融合细胞、瘤-瘤融合细胞以及目标的B-瘤融合杂交瘤细胞。HAT培养基（含次黄嘌呤H、氨基蝶呤A、胸腺嘧啶T）可选择性地让只有杂交瘤细胞存活。
原理在于：氨基蝶呤阻断DNA合成的主通路，细胞需依赖补救通路（由HGPRT酶催化）进行增殖。骨髓瘤细胞缺乏HGPRT酶，无法利用补救通路而死亡；B淋巴细胞虽有HGPRT酶但不能长期增殖；只有融合成功的杂交瘤细胞继承了B细胞的HGPRT酶和瘤细胞的无限增殖能力，可在HAT培养基中存活并扩增 。
二、第二次筛选：抗体检测筛选阳性克隆
HAT筛选后得到的杂交瘤细胞群仍可能分泌非目标抗体，需通过特异性抗体检测筛选出针对目标抗原的阳性克隆。常用方法包括：
ELISA法（*常用）
将目标抗原包被于酶标板，加入杂交瘤细胞培养上清，若存在特异性抗体，则与抗原结合，再通过酶标记二抗显色检测。OD值高于阴性对照2.1倍以上判定为阳性 。该方法操作简便、高通量，适用于可溶性抗原的检测 。
免疫荧光技术
适用于颗粒性抗原（如细胞表面抗原）。将表达目标抗原的细胞固定于载玻片，加入待测上清，再用荧光标记的二抗孵育，通过荧光显微镜观察是否出现特异性荧光信号 。
流式细胞术
可快速、定量分析单个杂交瘤细胞是否分泌特异性抗体。将荧光标记的抗原与细胞共孵育，通过流式细胞仪检测结合信号，实现活细胞分选，效率高、纯度好 。
免疫组化（IHC）
利用组织切片检测抗体与抗原的结合能力，适用于研究抗体在组织中的定位与表达，常用于验证抗体的特异性 。
三、克隆化培养：确保单克隆性
抗体阳性孔需进行克隆化，以确保细胞来源于单个祖先细胞，避免抗体分泌不稳定。常用方法有：
有限稀释法：将细胞稀释至每孔0.5–1个细胞，培养后筛选单克隆生长孔，重复2–3次 。
流式细胞分选法：利用荧光标记抗原直接分选阳性单细胞，效率高、纯度高 。
