一、实验前准备守则：确保系统稳定
试剂与耗材检查
所有试剂使用前需从2–8℃冰箱取出，室温平衡15–30分钟，避免冷凝水影响反应体系；
检查浓缩洗涤液是否有结晶，若有则置于室温轻摇至完全溶解后再稀释（1:20，蒸馏水）；
TMB显色液需避光保存，若已变蓝则表明氧化失效，禁止使用；
标准品为冻干粉时，需按说明书用标准品稀释液复溶，静置10分钟并轻柔颠倒混匀。
设备与环境准备
酶标仪预热至稳定状态，确认450nm滤光片正常工作；
恒温孵育箱设定为37℃，避免温度波动；
准备洁净EP管、吸头、多道移液器，并避免交叉污染。
二、ELISA试剂盒样本处理守则：保障检测真实性
所有样本建议分装保存，避免反复冻融导致蛋白降解。
1. 加样规范
使用单道或多道微量加液器，确保加样量准确（通常为50–100 μL）；
加样顺序：先加标准品，再加待测样本，*后加酶标试剂；
控制加样时间在5分钟内完成，防止反应起始时间不一致。
2. ELISA试剂盒温育控制
包被板加盖封板膜，防止蒸发和污染；
严格控制温育时间与温度（通常为37℃、60分钟），避免过长或过短；
温育期间勿频繁开关孵育箱门。
3. 洗涤要求
手工洗板：甩尽液体后，每孔加入350 μL洗涤液，浸泡1–2分钟，重复5次，拍干彻底；
自动洗板机：确认冲洗压力适中，避免孔间交叉污染；
洗涤不充分会导致非特异性结合，增加背景信号。
4. 显色与终止
显色剂A、B液现配现用，加入后避光反应10–30分钟；
显色时间需一致，建议使用计时器统一控制；
每孔加入50 μL终止液（如2M硫酸），终止后颜色由蓝转黄，15分钟内完成读数。
四、结果判读与质量控制守则
ELISA试剂盒标准曲线绘制
以标准品浓度为横坐标，OD450值为纵坐标，进行四参数拟合或线性回归；
标准曲线R² ≥ 0.99为合格，低于此值需重做实验；
高浓度点不得出现“钩状效应”（Hook effect）。
样本浓度计算
根据标准曲线查得OD值对应浓度，再乘以稀释倍数；
若样本OD值超出标准曲线范围，需重新稀释后复测。
质量控制指标
空白孔OD值应接近0；
阳性对照CV值 ≤ 10%，阴性对照无明显信号；
批间CV值 < 15%视为可接受变异。
五、安全与废弃物处置守则
实验过程中避免直接接触终止液、TMB等试剂，如不慎接触，立即用大量清水冲洗；
实验后废弃物分类处理：
酶标板、吸头：接触过生物样本，按生物污染耗材高压灭菌后处置；
TMB显色液：易燃有机物，归为易燃类危废；
终止液（含强酸）：腐蚀性危废，单独封装并标注；
所有危废交由有资质机构统一回收，严禁随意倾倒。
