抗体亲和力：高亲和力抗体能在较宽浓度范围内与抗原稳定结合，线性范围更宽；低亲和力抗体可能在高浓度抗原时出现结合饱和，导致线性范围变窄。

抗体浓度：包被抗体或检测抗体浓度过高，易在低抗原浓度时信号饱和；浓度过低则高浓度抗原时信号不足，需通过预实验优化浓度比。

抗原纯度与结构：抗原纯度低或存在多聚体/降解产物，可能与抗体发生非特异性结合，干扰线性关系。

酶标试剂活性：酶标记物活性不稳定或标记效率低，会导致信号强度与抗原浓度不成正比，尤其在高浓度端易出现“钩状效应”（信号下降）。

样本稀释比例：样本未按说明书稀释或稀释液选择不当，可能导致抗原浓度超出试剂盒线性范围，需确保稀释后的样本浓度落在推荐区间内。

温育时间与温度：温育时间不足或温度波动，会影响抗原抗体结合效率和酶促反应速率，导致标准曲线线性变差。

仪器灵敏度：酶标仪检测波长不准确或吸光度读数线性范围窄，会限制试剂盒的实际检测线性（如吸光度超过仪器量程时数据失真）。

底物与终止液：底物显色时间过长或终止液加入顺序错误，可能导致显色强度与抗原浓度偏离线性。