ELISA线性范围优化核心策略
一、标准品稀释方案优化
梯度稀释设计
采用倍比稀释法（1:2、1:4、1:8...）而非等距稀释（如0、10、20、30 ng/mL），更符合免疫反应非线性特征。
示例：1000 pg/mL → 500 → 250 → 125 → 62.5 → 31.25 → 15.625 pg/mL（覆盖5个数量级）。
稀释液选择
使用样本基质匹配的稀释液（如血清样本用试剂盒专用血清稀释液，避免PBS直接稀释导致基质效应）。
低浓度标准品（＜10 pg/mL）需用含0.1% BSA的PBS稀释，减少管壁吸附损失。
二、ELISA试剂盒样本预处理改进
稀释倍数调整
若样本浓度超出线性上限（如OD值＞2.0），需用试剂盒配套稀释液梯度稀释（1:5、1:10...），避免用水或PBS稀释。
示例：实测OD值2.5（标准曲线上限对应OD=1.8）→ 1:2稀释后OD=1.3（落入线性范围）。
去干扰预处理
高脂样本（如脑组织匀浆）需12000 rpm离心10分钟取上清，或用脱脂奶粉（5%）封闭干扰物质。
高盐样本（如尿液）可通过透析袋（MWCO 3.5 kDa）透析2小时去除离子干扰。
三、ELISA试剂盒实验操作参数优化
孵育时间与温度
37℃孵育60分钟（常规）→ 若低浓度样本信号弱，可延长至90分钟（提升灵敏度，线性下限降低）。
4℃过夜孵育（适用于难检测样本），但需同步做标准曲线，避免温度对线性斜率的影响。
洗涤条件
洗涤液需新鲜配制（含0.05% Tween-20的PBS），每孔洗涤3次（每次浸泡30秒），避免残留液影响OD值。
洗涤后拍干酶标板（用吸水纸轻拍，勿摩擦包被孔），减少背景干扰。
四、标准曲线拟合方法
优先非线性拟合
采用四参数Logistic回归（4PL） 拟合（推荐软件：GraphPad Prism、ELISA Calc），较线性拟合（R²≥0.99）更贴合免疫反应曲线。
排除异常值
标准品孔OD值变异系数＞15% 时需剔除（如8个复孔中1个OD值偏离均值3倍SD），重新拟合曲线。
线性范围验证流程（实操模板）
预实验：用3个梯度稀释的样本（高、中、低浓度）检测，初步判断线性范围是否覆盖。
ELISA试剂盒正式验证：
选5个浓度点（覆盖预期线性范围），每个浓度3次重复。
计算回收率（80%-120%）和相关系数R²（4PL拟合R²≥0.99）。
报告参数：记录线性范围（如5 pg/mL–2000 pg/mL）、LOD（5 pg/mL）、回收率均值（95%）。
