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RNA提取常见问题与解决方法—— 突破难题|提取时去除DNA污染

点击次数:70次     发布时间:2025/11/12 11:06:34

        今天小编继续和大家来聊一下RNADNA污染的问题。既然知道了RNA中有DNA污染对于我们后续的PCRqPCR是有影响的,那接下来关心的问题就是怎么消除或*小化它的影响?我们常用或经典的方法就那么1-2种。

目前了解到的在市面上在提RNA时去基因组DNA的方法有这么几种:

1. 提取溶液组分调整

     提取溶液组分调整,是基于DNARNA的特性来完成的,*常见的是类似于Trizol的方法(比如全式金的TransZol Up等,宣称可以一定程度上去除DNA污染,应该就是这个原理),调整溶液的pH,使得DNA在分层后的中间层,RNA在上层的水相,这样吸走RNA的时候,如果不触及中间层,则绝大部分的DNA都会留在中间层,RNADNA的含量就会很少,提取的效果就像上面图片中的泳道2-3的效果,几乎看不到基因组DNA的污染。

    有一点需要注意的是,这种类型的试剂对于样本的pH或影响pH较多的样本,在提取后是有可能变成泳道5中的情况的。之前遇到过有人提取菌液的RNA,怎么提都有DNA污染,建议离心后直接用试剂去裂解,就几乎没有了,也就是说菌的重悬Buffer中的pH异常,导致类似于Trizol试剂提取时pH异常,*终导致RNADNA区分不开。

2. 提取过程中加入DNase来去除DNA

    提取过程中去除DNA,多见于使用柱提法来完成RNA提取的试剂盒,这种试剂盒前期一般会有一些样本裂解的过程,在样本裂解后,一般会上有硅基质的柱子来吸附里面的核酸(比如天根的DP441就是这个类型的),柱子本身可以吸附DNARNA,只想保留RNA的话,一般会加入DNase到柱子上去消化掉其中的DNA。由于裂解液的残留会一定程度上抑制DNase的活性,所以我们可以看到,加入到柱子上消化的DNase的量会远大于我们常规对于提取后的RNA消化时的用量,这是为了以大量的DNase来抵消活性被抑制导致消化不足,有DNA残留的情况出现。

 

  基于之前提到的原因,少量的裂解液和其它的污染物,可能会对DNase活性有抑制,所以这种情况下,可能会有痕量的DNA残留,这个级别的DNA残留大多数情况下并不会明显影响后续的实验,如PCRqPCR等。但是如果对DNA污染要求非常严格,还是要注意一下这种情况。

3. 用不同的吸附柱去除DNA--基因组DNA去除柱

     基因组DNA去除柱主要是利用基因组DNARNA的结构差异,同时利用吸附介质的特异性来区分和结合基因组DNA,从而达到基因组DNA去除的目的。大体的原理是利用DNA(双链)和RNA(单链),在不同缓冲条件和介质下吸附能力的不同,基因组DNA去除柱利用这一结构差异,通过专门设计的吸附介质和缓冲体系,选择性地结合并清除样品中的基因组DNA,而不会影响RNA的质量。

     从原理上可以看出,如果DNA有断裂,或者有解链,也是会有微量的DNA不会被吸附,*终到RNA里面去的。基因组DNA去除柱,可以去除绝大部分的基因组DNA,而且在样本量较少的时候效果比较好,比如,少于100W个细胞,低于20 mg的组织样本等;当样本量变大时,去除基因组DNA的效果就会明显的下降。

  所以我们在选择这种方法去除基因组DNA污染时,要考虑好适用的范围。

 

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