1.抗体特异性不足或交叉反应：某些抗体可能会与非目标抗原结合，导致假阳性结果。这种交叉反应尤其在自体免疫疾病检测中容易出现，因相似结构的抗原较多。

 

2.样本处理不规范：样本处理过程中的不规范操作，如保存温度不当、采集时污染等，也可能导致检验结果失真。

 

3.试剂稳定性与质量不均：过期或保存不当的试剂可能会降低检验灵敏度或特异性。

 

4.操作人员技术水平和经验不足：操作人员的技术水平和经验不足，同样可能导致误诊，如在操作步骤中未能严格遵循标准流程或未能正确解读检验结果。

 

5.实验环境控制不当：ELISA实验需在特定温度和湿度条件下进行。若条件控制不当，可能影响实验结果准确性。例如，温度过高可能导致抗原或抗体变性，湿度过高则可能使非特异性结合增加。

初次使用前按单次用量分装（50-100μL/管），避免反复冻融导致荧光素脱落或结构破坏‌。冻融3次后流式信号可能下降30%‌。

稀释后抗体需4℃保存，避免含叠氮化钠等抑制剂的稀释液影响HRP酶活性‌。

优化抗体浓度与时间：高浓度或过孵育易导致非特异性结合，建议梯度测试（1:100-1:2000）‌。

洗膜需彻底：TBST缓冲液清洗5次×5分钟，减少背景干扰‌。

‌假阳性信号‌

使用基因敲除（KO）细胞或质谱验证抗体特异性，避免交叉反应‌。

多抗体互证：如N端与C端抗体联合使用‌。

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假阴性信号‌

检查样本处理：磷酸化抗体需严格避免蛋白酶降解，抗原修复不足可能导致PD-L1等低丰度蛋白检测失败‌。

阳性对照：建立过表达细胞系或商用标准品（如HEK293裂解液）‌。

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批次一致性测试‌

 

要求供应商提供批次检测报告（效价、纯度、内毒素），优先选择单克隆抗体‌。

新批次抗体需通过加速老化（37℃ 7天）和反复冻融（≥5次）验证稳定性‌。

查阅独立文献（如CiteAb数据库）验证抗体实际应用效果，避免依赖供应商理想化数据‌。

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样本兼容性‌

固定方法影响：甲醇可能破坏某些表位，需验证抗体对固定剂的耐受性‌。

缓冲液优化：添加0.1-0.3% Tween-20可改善信噪比‌。

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质控策略‌

阴性对照：使用CRISPR敲除细胞或siRNA处理样本‌。

同型对照（Isotype control）：流式实验中不可或缺‌。

通过上述策略，可系统性降低抗体实验误差，提升数据可靠性‌。