1. 前期准备（1-2小时）

需提前完成包被板的活化（如使用羧基板需EDC/NHS处理）、标准品梯度稀释及样本预处理。若采用预包被板可节省30分钟，但需注意商品化板子的批次差异可能影响重复性。

 

2. 关键反应阶段（2.5-4小时）

• **包被与封闭**：抗原包被后37℃孵育1小时或4℃过夜（后者可提升灵敏度），封闭液处理通常需1小时。

• 抗体结合：样本孵育时间与抗体亲和力相关，高亲和力抗体可缩短至30分钟，但低滴度样本建议延长至2小时。

• 酶标二抗：现代辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗孵育时间已优化至45分钟以内。

 

3. 信号检测（30分钟）

采用化学发光底物时读数窗口仅5-15分钟，而TMB显色需精确控制终止时间。自动化酶标仪可同时读取96孔数据，但建议分批次检测以防底物衰减。

加速方案

微流控ELISA芯片可将总时长压缩至90分钟，通过增加流体剪切力加速分子结合；部分试剂盒采用纳米金标记技术，省去酶促反应步骤。但快速方法需验证与常规ELISA的相关性（R²>0.9）。

 

注意事项

• 每步洗涤需彻底（3-5次PBST冲洗）但不超过建议时间，防止非特异性结合。

• 临界值样本建议设置复孔，这会增加20%操作时间但可提高可信度。

• 若需进行中和抗体检测，需额外预孵育步骤（+1小时）。

 

实际耗时还需考虑人员操作熟练度，经验丰富的技术员可并行处理多块板子提升效率。对于GMP环境下的验证实验，建议预留8小时以完成完整的系统适应性测试。

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