复苏慢速冷冻和快速复苏的过程,实际上是为了在细胞内外形成一种平衡的物理化学环境,从而*大限度地保护细胞结构和功能的完整性。细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞复苏,是把冻存在-80℃冰箱或液氮中的细胞快速解冻重新培养,细胞恢复生长的过程。
细胞慢冻快融原则
除了冻存保护剂之外,冷冻和升温的速度也直接影响细胞的存活率。做过细胞冻存复苏的人都可能听说过“慢冻快融”的原则。这样可以*大限度的保存细胞活力。如今细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
慢冻是为了减少细胞内的水分,从而降低水分结冰导致的伤害。为了说清这个道理,需要一点点物理学知识。我们知道,水溶液结冰是一个溶质溶剂相互作用的过程。溶液的浓度越高,开始结冰的温度(冰点)就越低。溶液结冰时,作为溶剂的水优先结冰,同时把溶质外排,这样就导致溶质的浓度越来越高。溶质的浓度越高,则剩下的溶液要进一步结冰,需要的温度就更低,直到一个*终完全结冰的温度(共熔点)。也就是说,水溶液的结冰是一个温度逐渐降低(从冰点*后降低到共熔点)、溶液浓度逐渐升高的过程。
在慢速冷冻时,细胞外液逐渐结冰,导致溶质浓度升高,形成高渗环境。此时,细胞内的水分会缓慢向外渗透,避免细胞内冰晶的剧烈形成。如果冷冻速度过快,细胞内水分来不及外流,就会在细胞内形成尖锐的冰晶,刺破细胞膜和细胞器,造成不可逆的损伤。因此,慢速冷冻让细胞有足够的时间适应外界环境的变化,减少冰晶对细胞的机械破坏。

而快速复苏则是为了迅速跳过冰晶重结晶的危险温度区间(通常在-80℃至-40℃之间)。在这一区间,冰晶容易重新排列并增大,对细胞造成二次伤害。快速升温可以迅速将细胞从低温状态恢复到生理温度,减少冰晶生长的机会,同时也能避免细胞因长时间处于高渗环境而脱水死亡。
此外,冷冻保护剂(如DMSO或甘油)的使用也起到了关键作用。它们能降低冰点,减少冰晶的形成,并在细胞膜表面形成保护层,提高细胞的耐冻能力。然而,这些保护剂在高温下可能对细胞产生毒性,因此快速复苏也能缩短细胞暴露于保护剂的时间,提高存活率。
但是这样的结冰过程也是有条件的,那就是外界的温度不能急剧降低,让溶剂结冰的时候,有足够的时间把溶质排除到冰体之外。否则,温度降低太快,溶质就会被困在溶剂中间一同凝固,这在物理学上叫玻璃化凝固,而非真正的结冰。慢冻就是为了让冻存液真正结冰,结冰的过程中,冻存液的浓度会逐渐提高,渗透压也逐渐提高,细胞内的水分就会逐渐渗透到细胞外,从而减弱细胞内水分结冰导致的伤害。
但是这样的结冰过程也是有条件的,那就是外界的温度不能急剧降低,让溶剂结冰的时候,有足够的时间把溶质排除到冰体之外。否则,温度降低太快,溶质就会被困在溶剂中间一同凝固,这在物理学上叫玻璃化凝固,而非真正的结冰。慢冻就是为了让冻存液真正结冰,结冰的过程中,冻存液的浓度会逐渐提高,渗透压也逐渐提高,细胞内的水分就会逐渐渗透到细胞外,从而减弱细胞内水分结冰导致的伤害。
理论和实践表明,细胞冷冻的速度控制在每分钟降低1℃效果好。