人诱导性多能干细胞诱导实验概要：人诱导性多能干细胞（iPSC）诱导
在近年来生命科学领域的研究中，人诱导性多能干细胞诱导技术无疑占据了一席之地。这一技术的核心在于，通过将特定的转录因子导入已分化的体细胞中，可以使其“重编程”回到一种类似于胚胎干细胞的状态，即诱导性多能干细胞状态。这些iPSC具有自我更新能力和分化为多种细胞类型的潜能，为再生医学、疾病模型构建以及药物筛选等领域提供了前所未有的研究工具和平台。
随着技术的不断进步，科学家们已经成功地从多种类型的体细胞中诱导出了iPSC，包括皮肤细胞、血液细胞等。这些iPSC不仅在形态上与胚胎干细胞相似，更重要的是，它们表达了一系列的胚胎干细胞标志物，并且在适当的条件下可以分化为各种特定的细胞类型，如神经元、心肌细胞等。
主要试剂
DPBS、0.25% Trypsin、1mg/mL胶原酶Ⅳ、丝裂霉素C、0.1%明胶、Polybrene、PE-TRA-1-60抗体、hESCs培养液、细胞基础培养液
条件培养液
hiPSCs的诱导是一个长时间的过程，在饲养层质量下降之后，可以选择使用条件培养液。条件培养液中含有饲养层细胞所分泌的各种因子，这些因子对于ESCs或者iPSCs的生长是非常重要的。
接种好的饲养层细胞换成hESCs培养液，第二天收集培养液，此培养液就叫条件培养液。条件培养液可以连续收集七天。用之前要用0.22 μm滤器过滤。
主要设备
35 mm培养皿，4孔培养板，滤器，2 mL、5 mL、10 mL、15 mL、25 mL、50 mL离心管，细胞计数仪，巴斯德管，倒置显微镜，培养箱，水浴锅，生物安全柜，体视镜
实验材料
供体细胞、4因子病毒
实验步骤
长满的人包皮成纤维细胞或者胎儿来源的成纤维细胞，按照常规的细胞传代方法，将供体细胞按2×104cells/cm2接种到12孔培养板的一个孔，24 h左右后使用，
注意：最好选择细胞低于7代的供体细胞，以保证诱导效率。
（2）病毒进行感染
①先把培养液换成成纤维细胞培养液，再把四个因子的病毒同时加到事先接种好的供体细胞里（把每个因子20 μL病毒,共80 μL病毒加入到1 mL的成纤维细胞培养液中），同时加入Polybrene至终浓度为8 μg/mL以增加感染效率。
！注意：感染前用对照GFP进行标定，感染时根据标定的病毒滴度加入所需的病毒量。一般用不同滴度的GFP病毒感染细胞，摸索出刚好感染效率在80-100%的病毒量，如果病毒量过多，会导致被感染的供体细胞凋亡。
②培养12～19 h后更换新鲜的细胞基础培养液。
（3）hiPSCs诱导
①待被感染供体细胞增殖到70%～80%，开始准备饲养层，饲养层细胞密度同hESCs建系密度。
注意:最好使用现做的饲养层，而不选用冻存复苏的。
②待被感染供体细胞基本长满。此时可以用0.25%Trypsin把细胞消化成单细胞，收集细胞进行计数，离心，按照1×104 cells/cm2 接种到饲养层上，仍然用细胞基础培养液
注意：计数可采用普通的血球计数板计数或者自动细胞计数仪计数。
③第二天，弃去细胞基础培养液，换成hESCs培养液。
④观察细胞及其变化，大概7～10天后，会出现小克隆
⑤更换新鲜的hESCs培养液并观察克隆，克隆逐渐长大，13天后细胞每天都必须进行换液。
⑥14天后开始准备挑克隆，提前一天准备饲养层，可以选择用24孔培养板进行第一次挑克隆，注意要一个克隆一个孔，重编程完全的克隆可以继续培养.
注意：挑克隆之前进行hESCs特异性的膜蛋白标志PE-TRA-1-60的活细胞染色【在不影响细胞活力的情况下，对核酸或特定蛋白的染色方法。不需对细胞进行较复杂的处理。如果针对膜染色，仅需将抗体按特定比例稀释加入到培养液中，1-2 h后观察。之后，细胞换液，继续培养。】，染色前换新鲜的培养液，按1:200的浓度加入抗体，1 h后弃去培养液，换成新鲜的培养液，荧光镜下进行观察，挑取TRA-1-60阳性的克隆进行建系
⑦供体细胞接种到饲养层后的第7天，饲养层细胞活力逐渐变小，有些开始凋亡，这个时候开始加条件培养液。
⑧挑取克隆后传代及其鉴定。
iPSC诱导技术仍面临着诸多挑战。如何提高诱导效率、降低基因突变风险、以及如何更好地控制细胞分化方向，都是当前研究的热点和难点。此外，iPSC的临床应用也受到了伦理、法律和社会因素的制约，需要科学家们进行深入的探讨和权衡。
iPSC诱导技术仍然被视为未来医学领域的一次革命性突破。它有望为众多难治性疾病提供全新的治疗策略，甚至实现组织器官的体外再生和移植。随着技术的不断成熟和完善，我们有理由相信，iPSC诱导技术将在未来的生命科学研究中发挥越来越重要的作用，为人类健康事业作出更大的贡献。
