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蟹源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒通用原则

点击次数:858次     发布时间:2020/3/3 17:01:48

蟹源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒通用原则:
1,先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。
2, 扩增子的长度应不超过400bp,理想的能在100-150bp内,扩增片断约短,有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性
3, 保持GC含量在20%和80%之间,GC富含区容易产生非特异反应,从而会导致扩增效率的降低,及在SG分析中非特异信号。
4, 为了保证效率和重复性,应避免重复的核苷酸序列,尤其是G(不能有4个连续的G)
5, 将引物和探针互相进行配对检测,以避免二聚体和发卡结构的形成。
b),蟹源性成分探针法荧光定量PCR试剂盒探针设计指导
1,在设计引物之前设计探针
2,探针的Tm值应在68-70℃之间,如果是目测探针,则要仔细审查GC富含区。
3,探针的5’端要避免有鸟氨酸,5’G会有淬灭作用,即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在
4,选择C多于G的链作探针,G的含量多于C会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针。
6, 探针应尽可能的短,不要超过30个bp。
7, 检测探针的DNA折叠和二级结构。
 
    全新的热启动DNA聚合酶-Hot Start Taq DNA聚合酶,可在PCR反应的过程中抑制非特异扩增,从而最大限度地减少非特异性扩增产物的产生,提高荧光定量PCR反应的特异性;
    采用新型的荧光染料EvaGreen,与传统荧光染料相比,对PCR反应抑制更小,而且荧光信号更强,检测灵敏度更高;
    含有UNG的试剂盒可以防止PCR产物污染体系,进而有效防止实验过程中PCR产物的交叉污染;
TaqMan荧光定量PCR试剂盒提供了除引物、探针、模板外的所有实验所需组分,并配备2×Buffer,可完成不同类型荧光探针的实时荧光定量PCR反应,方便用户使用;

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