复苏后静置24小时，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，贴壁成功的活细胞会从悬浮的圆球状，逐渐伸展为扁平的梭形，细胞膜边界清晰完整，细胞质透亮有明显光泽，不会出现皱缩、碎裂的形态。

观察细胞整体分布状态，健康贴壁的细胞会在培养瓶底部均匀分散生长，不会大量成团聚集在局部区域，也不会成片漂浮在培养基中。

重点区分死细胞与活细胞：死细胞或未贴壁的细胞始终保持圆形收缩状态，悬浮在培养液里，部分细胞会出现细胞膜碎裂、胞内颗粒浑浊的情况，不会出现伸展形态。

‌操作验证确认法‌

完成24小时静置后，倾斜培养瓶，沿瓶壁缓慢吸走全部旧培养基，加入37℃预热的无菌PBS轻轻晃动30秒后吸出，镜下观察瓶底，形态舒展的梭形细胞不会随PBS冲洗脱落，仍牢固附着在瓶底，说明贴壁状态稳定。

更换预热的完全培养基后再次静置6小时观察，培养基清澈无大量漂浮细胞，瓶底细胞形态没有发生回缩变圆的情况，即可确认细胞已经完全贴壁成功。

 

正常复苏的MC3T3-E1细胞在接种后4-6小时就会开始初步贴壁，24小时左右完成稳定贴附，如果镜下观察到超过60%的活细胞已经完成形态伸展，就说明贴壁过程进展顺利。

贴壁成功的细胞会进入正常增殖周期，后续2-3天内细胞汇合度会逐步提升至80%，不会出现长时间生长停滞、大量漂浮死亡的情况，也能反向佐证前期贴壁状态合格。