本流程基于双抗体夹心ELISA原理，通过450nm波长下的吸光度检测，精准定量样本中抗着丝点抗体（ACA/CENP）的浓度，全程覆盖样本处理、试剂准备、操作执行到结果计算的全环节，保证实验重复性与结果准确性。
一、检测原理
采用双抗体夹心法，将纯化的ACA/CENP抗体包被在微孔板上，依次加入待测样本与HRP标记的检测抗体，形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物。经彻底洗涤去除未结合杂质后，加入TMB底物显色，TMB在HRP催化下转为蓝色，加入终止液后变为稳定黄色，颜色深浅与样本中ACA/CENP浓度呈正相关，*终通过酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），结合标准曲线计算得到样本实际浓度。
二、实验前准备
1. 仪器与耗材
核心设备：带450nm滤光片的全自动酶标仪、37℃恒温培养箱
移液工具：经校准的高精度排枪与对应枪头（量程覆盖0.5~1000μL）
辅助耗材：无屑吸水纸、一次性封板膜、无菌离心管、双蒸水
适配洗板设备：手工洗板配套容器或校准后的自动洗板机
2. ELISA试剂预处理
试剂盒从2~8℃冷藏环境取出，室温平衡20~30分钟，未使用的剩余板条立即装入密封袋放回2~8℃保存。
浓缩洗涤液若出现结晶，37℃水浴加温至完全溶解后，按说明书比例用双蒸水稀释为1×工作液（如20×浓缩液按1:19比例稀释）。
所有液体组分使用前充分轻柔摇匀，不同批号试剂严禁混用。
三、样本采集与预处理
血清样本：用无热原试管采集全血，避免刺激细胞，3000转离心10分钟，小心分离上层血清，避免混入红细胞。
血浆样本：采用EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝管采集，3000转离心30分钟取上清，严禁使用含NaN3的样本（会抑制HRP酶活性）。
其他样本：细胞上清液3000转离心10分钟去除颗粒；组织匀浆加入生理盐水充分研磨后，3000转离心10分钟取上清。
样本保存：暂不检测的样本按单次用量分装，-20℃冻存，全程避免反复冻融，检测前室温充分均匀解冻。
四、标准品梯度配制
以初始浓度400ng/mL的原倍标准品为例，按倍比稀释法配制6个梯度标准品：
取150μL原倍标准品加入150μL标准品稀释液，得到200ng/mL的5号标准品
取150μL5号标准品加入150μL标准品稀释液，得到100ng/mL的4号标准品
依次类推，逐步稀释得到50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL的3、2、1号标准品
0号标准品直接使用标准品稀释液，作为空白阴性对照。
五、标准化操作步骤
加样：分别设置空白孔、6个梯度标准孔、待测样品孔。标准孔每孔精准加样50μL；待测样品孔先加40μL样品稀释液，再加10μL待测样本，*终样本稀释倍数为5倍。加样时将液体直接加到酶标板孔底部，避免触碰孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用一次性封板膜密封酶标板，放入37℃恒温箱准确温育30分钟，保证所有孔位反应时长完全一致。
ELISA洗涤：揭掉封板膜，弃去孔内液体并甩干，每孔加满洗涤液，静置1分钟后弃去，重复操作5次，*后在干净无屑吸水纸上彻底拍干。
加酶：除空白孔外，每孔精准加入50μL HRP标记酶标试剂，操作全程避免交叉污染。
二次温育：再次封板后，37℃恒温准确温育30分钟，重复上述5次洗涤操作，彻底拍干孔内残留液体。
显色：每孔先加入50μL显色剂A液，再加入50μL显色剂B液，轻轻震荡混匀，37℃避光环境下准确显色15分钟。
终止反应：每孔加入50μL终止液，此时孔内蓝色会立即转为稳定黄色，轻轻晃动混匀。
450nm吸光度测定：以空白孔调零，在加入终止液后的15分钟内，用酶标仪在450nm波长下依次测定所有孔的OD吸光度值，读数前用干净滤纸擦净酶标板底部外侧残留液体，避免光斑干扰。
六、结果计算与质量控制
以标准品的浓度为横坐标，对应测得的OD值为纵坐标，绘制标准曲线，计算得到直线回归方程式。
将待测样本的OD值代入回归方程式，计算出样本的初始浓度，再乘以5倍的样本稀释倍数，得到样本中ACA/CENP的实际浓度。
若样本OD值超出*高标准品的线性范围，需用样品稀释液将样本进一步稀释n倍后重新检测，*终结果乘以总稀释倍数（5×n）。
每批次实验必须同步做标准曲线，标准品建议设置复孔，保证批内CV值控制在10%以内，确保结果可靠性。
七、ELISA关键注意事项
底物B液对光敏感，全程避光保存，避免长时间暴露在自然光下。
所有操作严格控制加液顺序、反应时长与温度，避免不同孔位反应条件不一致引入系统误差。
实验废弃物按传染性生物试剂规范处理，避免直接接触终止液与显色底物，操作后及时洗手。
