显色弱是ELISA实验中*常见的问题之一，直接影响结果的可信度和数据的可重复性。如果你正为此困扰，别担心，大多数情况都能通过系统排查解决。
以下是ELISA显色弱10个*常见且*直接的原因，按发生频率和影响程度排序，帮助你快速定位问题根源：
1. 试剂未平衡至室温
原因：试剂从2–8℃冰箱取出后直接使用，温度差异导致反应效率下降，酶活性受限。
解决方案：所有试剂（包括样本）在使用前于室温平衡至少20–30分钟。
2. 显色时间不足
原因：TMB等底物反应需要足够时间才能充分显色，过早加入终止液会导致信号偏弱。
解决方案：根据说明书控制显色时间，建议在显微镜下观察梯度显色形成，或通过OD值动态监测（如620 nm波长下OD达0.6–0.65为宜）。
3. 样本中目标蛋白浓度过低
原因：待测物浓度低于试剂盒检测下限（LOD），抗原-抗体结合不足。
解决方案：
确认样本类型是否符合检测要求；
尝试浓缩样本或选择更高灵敏度的试剂盒（如高敏ELISA）；
优化样本稀释倍数。
4. 抗体问题（一抗/二抗效价不足或搭配错误）
原因：
一抗与目标蛋白结合能力弱（保存不当、反复冻融）；
二抗与一抗物种不匹配，或HRP酶标记失活。
解决方案：
检查抗体保存条件，避免反复冻融；
确认抗体种属匹配性；
使用新鲜配制的偶联试剂。
5. 洗板不彻底或过度洗板
原因：
ELISA洗涤液未注满孔、洗板针堵塞导致残留干扰；
洗涤冲击力过大、浸泡时间过长，洗脱已结合的抗原-抗体复合物。
解决方案：
确保洗液充满每孔，检查洗板机通畅性；
严格按照说明书控制洗涤次数、时间和力度。
6. 底物（如TMB）失效或配制不当
原因：显色剂过期、保存不当（光照、高温）、A/B液混合后加入或滴加量不足。
解决方案：
使用前检查显色剂是否澄清无沉淀；
显色剂临用前配制，先加A液再加B液，不可混合后加入；
避免使用肉眼可见浅蓝色的TMB溶液。
7. 酶标仪设置错误
原因：滤光片波长选择不当（如应使用450 nm主波长+620/630 nm参比波长），或仪器未校准。
解决方案：
确认酶标仪波长设置正确；
定期校准仪器，避免读数偏差。
8. 样本中含有干扰物质
原因：高脂血症、溶血、类风湿因子、蛋白酶或叠氮钠（NaN₃）等可抑制酶活性或干扰抗原-抗体结合。
解决方案：
ELISA样本避免溶血或脂浊；
不使用含NaN₃的防腐样本；
必要时进行样本预处理（如稀释、离心、加热灭活RF）。
9. 孵育温度或时间不足
原因：温育箱温度未达37℃，或定时不准导致反应不充分。
解决方案：
校正温育箱温度，避免多板重叠影响热传导；
使用准确计时器控制孵育时间。
10. 试剂盒过期或运输保存不当
原因：试剂盒超过有效期，或运输过程中温度失控导致抗体/酶失活。
解决方案：
检查试剂盒有效期；
确保运输时使用冰袋保温，避免高温长时间暴露。
