封闭液：针对目标蛋白的 “精准屏蔽”

 

检测糖基化蛋白时使用脱脂奶粉封闭，结果 WB 出现杂带 —— 脱脂奶粉中的糖基化杂质与抗体发生交叉反应。

 

✅ 差异化选择：

 

普通蛋白：5% 脱脂奶粉（室温封闭 1 小时，经济高效）

 

修饰化蛋白（磷酸化 / 糖基化）：1% 无修饰 BSA（纯度≥99%，减少杂质干扰）

 

组织样本：10% 与一抗宿主同源的血清（如兔抗用山羊血清，降低种属间 Fc 受体结合）

 

进阶技巧：封闭时轻轻摇晃容器，确保膜 / 板均匀覆盖，避免局部未封闭区域2. 抗体孵育：浓度与时间的 “黄金平衡”

 

抗体浓度过高易导致非特异性结合，浓度过低则信号微弱。实验发现，一抗4℃过夜孵育时，某些磷酸化抗体在1:1000稀释下出现背景偏高，调整为1:2000后信噪比显著提升。

✅ 优化策略：

- 梯度测试：首次使用抗体时，建议设置1:500、1:1000、1:2000三个稀释梯度，通过预实验确定*佳浓度。

- 时间控制：室温孵育1小时适合高亲和力抗体，而低丰度靶蛋白可延长至4℃ 16小时（需防止缓冲液蒸发）。

- 

 

缓冲液改良：含0.1% Tween-20的TBST可减少非特异性吸附，但检测膜蛋白时建议改用0.05% Triton X-100以保护蛋白结构。

 

⚠️ 常见误区：直接沿用文献中的稀释比例，忽略抗体批次差异或实验体系变化（如不同品牌NC膜吸附能力不同）。

 

3. 洗涤环节：被低估的 “信号雕刻师”

 

三次TBST洗涤看似简单，实际影响*终结果的清晰度。案例：某实验室检测转录因子时，发现条带拖尾，后将每次洗涤时间从5分钟延长至10分钟，并增加至5次洗涤，背景问题彻底解决。

 

✅ 精准操作：

 

- 强度分级：首次洗涤可短暂（30秒）去除游离抗体，后续每次10分钟深度清洗。

 

- 温度协同：检测热不稳定蛋白时，改用4℃预冷的洗涤缓冲液。

- 边缘处理：用镊子夹住膜边缘震荡清洗，避免中心区域因液体涡流导致洗涤不充分。

 

🔬 延伸思考：对于弱信号靶标，可在末次洗涤后使用0.1% SDS短暂处理（30秒），适度暴露被掩盖的抗原表位，但需严格控制时间以防过度剥离。