为确保EHNV核酸检测结果的准确性和实验安全性，操作过程中需特别注意以下关键环节：
采样要求
采集发病期组织（如脾、肾）或血液样本，避免使用腐败样本
血液样本需使用EDTA抗凝管采集，避免凝血干扰
组织样本需立即置于RNA保护液中（如RNAlater）保存
核酸提取
提取后立即检测或-80℃保存，避免反复冻融
二、试剂配制与操作
标准品稀释
阳性对照需在独立区域进行梯度稀释（如10^2-10^7拷贝/μL），避免交叉污染
稀释时使用无RNase的枪头和离心管，涡旋振荡后短暂离心混匀
PCR体系设置
反应体系推荐20μL，含模板DNA、引物探针、Taq酶等组分
每批次需设置：
阳性对照（验证试剂灵敏度）
阴性对照（检测污染）
无模板对照（NTC）
程序参数
预变性：95℃ 5分钟
循环条件：95℃ 15秒 → 60℃ 60秒（40个循环）
荧光信号采集：退火阶段（60℃）
数据分析
阈值线（Ct值）设定为基线荧光信号3-15个循环的标准偏差
结果判定：Ct值≤35且扩增曲线呈“S”型为阳性
四、实验室安全与质控
分区操作
严格分区：试剂准备区、样本处理区、扩增区、产物分析区
各区物品禁止交叉使用，避免气溶胶污染
质控措施
每批实验需验证试剂盒灵敏度（检测限≤100拷贝/μL）
定期进行重复性测试（CV＜5%）
假阴性：检查样本保存条件或提取效率，重新验证引物特异性
假阳性：排查实验室污染，加强无模板对照检测
