在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

 

    在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。双位点一步法虽然高效便捷，但实验人员仍需谨慎优化操作流程以确保结果的准确性。针对钩状效应，可通过预实验确定样本的稀释倍数，或采用梯度稀释法进行检测。对于高浓度样本，建议先进行1:10或更高比例的稀释后复测，以避免抗原过量导致的假阴性。

   此外，实验中固相抗体的包被质量直接影响检测灵敏度。建议在包被阶段优化抗体浓度（通常为1-10 μg/mL）和包被时间（4℃过夜或37℃ 2小时），并通过封闭液（如1% BSA或5%脱脂奶粉）减少非特异性结合。酶标抗体的选择也需匹配固相抗体的抗原表位，避免交叉反应。

 

    操作中需注意反应体系的均一性。加入样本和酶标抗体后，可轻微振荡微孔板以确保充分混匀，但需避免气泡产生。温育时间通常控制在30-60分钟，温度稳定在37℃。洗涤步骤是关键，建议使用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液，每孔洗涤3-5次，彻底去除未结合物质。

 

     显色阶段需避光操作，TMB底物反应时间一般为10-15分钟，强阳性样本可能更快显色，需及时终止（加入2M H₂SO₄）。若使用OPD底物，则需注意其光敏感性及潜在致癌性。*后，酶标仪读取OD值时应选择与底物匹配的波长（如TMB为450nm，参考波长630nm）。

 

    为验证结果可靠性，每批次实验需设置空白孔、阴性对照和阳性对照。若出现钩状效应疑似情况，可结合其他检测方法（如Western blot）进行交叉验证。通过严谨的流程设计和细节把控，双位点一步法能高效服务于临床诊断和科研检测。