EMSA实验*关键的步骤就是设计探针

    （1）我们需要根据基因 Y 的启动子 DNA 序列来设计探针，探针是一段 DNA 双链，序列中要包含转录因子 X 的结合序列。结合位点可通过文献或生物信息学工具（如JASPAR、MEME）预测。

    （2）探针长度一般是20-40 bp，包含核心结合位点及两端保护序列。

    （3）探针是带标记的，可以带放射性的 p32，或者非放射性的生物素或地高辛（生物素/荧光标记需纯化至高纯度（HPLC级），避免游离标记物干扰）。

    当检测转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白或细胞核抽提出来的蛋白。如果是用纯化的转录因子蛋白去做 EMSA，那就可以排除其他分子的干扰，证明检测出来的蛋白-DNA探针结合是直接结合。

 

 

（4）探针设计需考虑结合位点的方向性。某些转录因子对结合序列的正反链具有偏好性，建议通过文献验证或设计正反向探针进行预实验。若使用生物素标记，需注意标记端应避开蛋白结合区域，通常标记在5'端或3'端的保护序列上，避免影响蛋白-DNA相互作用。

（5）阴性对照探针的设计同样重要。可采用突变型探针（如核心结合位点碱基替换）或无关序列探针，用于验证结合特异性。对于竞争实验，未标记的野生型探针应比标记探针浓度高50-100倍，才能有效竞争结合。

      实验时需优化结合条件：缓冲液中常含10 mM HEPES（pH7.9）、50 mM KCl、1 mM DTT等成分，可添加5%甘油增加稳定性。非特异性竞争剂（如poly(dI-dC)）用量需梯度测试，通常每个反应体系加入0.1-0.5 μg。对于低丰度转录因子，可延长4℃孵育时间至30分钟，或采用低温电泳（4℃）维持复合物稳定性。

      值得注意的是，某些转录因子需要辅助因子才能形成超迁移复合物（supershift），此时可提前加入特异性抗体进行验证。若出现多条迁移带，可能是由于蛋白存在不同修饰状态或形成多聚体所致。