用试剂盒中提供的 DNA dilution buffer 将 E.coli Control DNA 进行梯度稀释，稀释浓度依 次为 300pg/μl 、30pg/μl 、3pg/μl 、300fg/μl 、30fg/μl。具体操作如下：
1.将试剂盒中的 E.coli Control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后， 轻微振荡混匀，简短快速离心。
2.取 5 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5。
3，SD1 管中加入 198μl DNA dilution buffer，其余管中分别加入 180μl DNA dilution buffer。
4,取 2μl E.coli control DNA 加入 SD1 管中， 然后涡旋振荡混匀 5-10s 后短时快速离心 5s，涡旋振荡和快速离心各重复 3 次。
5,按表 2 依次进行 5 次梯度稀释操作，稀释操作同步骤 4。
根据待测样本的残留量设置 ERC 中 E.coli Control DNA 的加样浓度 （以制备加 45pg E.coli Control DNA 的样本 ERC 为例），操作如下：
1 ，取待测样本 100μl，加至 1.5ml 干净的离心管中；
2 ，加入 1.5μl SD2，混匀，标记为样本 ERC。
注：样本 ERC 和同批待测样本需一起进行样本前处理。
根据实验设置阴性质控，操作如下：
1 ，取 100μl 样本基质溶液（或洗脱液）加至 1.5ml 干净的离心管中标记为阴性质控 NEG。
注：阴性质控 NEG 样本和同批待测样本需一起进行样本前处理。
1 ，根据所要检测的标准曲线及待测样本数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。 反应孔数=（5 个浓度梯度+1个无模板对照 NTC+1 个阴性质控 NEG+待测样本×2）×3
注：待测样本×2 是为了让每个待测样本检测时都同时做样本 ERC。
2 ，根据反应孔数计算本次实验所需的各组分的所需总量以制备 pre-mix：
2×Taqman master mix= (反应孔数+2) ×15μl （含有 2 孔的损失量） 10×E.coliqPCR mix=（反应孔数+2） ×3μl
RNase-free H2O=（反应孔数+2）×2μl
3 ，各试剂置于冰上融化，振荡混匀，按表 3 所示进行加样：
4. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微振荡混匀，短时间快速离心后放入 qPCR 仪中。
qPCR 程序参数设置（以 ABI 7500 为例）：
1.创建空白新程序，选择绝对定量检测模块。
2.创建新检测探针，命名为 E.coli-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，淬灭基团为 none,检测 参比荧光为 ROX。
3.设置两步法反应程序：50oC 2min, 95oC 预变性 10min；95oC 10 sec，58oC 1min，40 个循环； 反应体积为 30μl。
1.在 Results 的 Amplification plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.05 ，点击 Analyze，此时 可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2.在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000 、300 、30 、3 、0.3（含义为每孔的 DNA 量，单位为 pg），并且在相 应的 Sample Name 一栏命名为 SD1 、SD2 、SD3 、SD4 、SD5。
3.在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NEG 孔、待测样本孔、样本 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC 、NEG 、S 、ERC ，之后点击开始键。
4.在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、 R2。
5.在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模版对照 NTC、阴性质控 NEG、 待测样本、样本 ERC 的检测值。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/ml 样本。
注:根据待测样本和样本 ERC 的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在 50%-150%之 间。
