实验操作过程：
一、E.coli DNA 定量参考品的稀释及标准曲线的制备
用试剂盒中提供的 DNA dilution buffer 将 E.coli Control DNA 进行梯度稀释，稀释浓度依 次为 300pg/μl 、30pg/μl 、3pg/μl 、300fg/μl 、30fg/μl。具体操作如下：
1.将试剂盒中的 E.coli Control DNA 和 DNA dilution buffer 置于冰上融化，待完全融化后， 轻微振荡混匀，简短快速离心。
2.取 5 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 SD1 ，SD2 ，SD3 ，SD4 ，SD5。
3，SD1 管中加入 198μl DNA dilution buffer，其余管中分别加入 180μl DNA dilution buffer。
4,取 2μl E.coli control DNA 加入 SD1 管中， 然后涡旋振荡混匀 5-10s 后短时快速离心 5s，涡旋振荡和快速离心各重复 3 次。
1. 取出预混的qPCR Master Mix（含荧光染料和DNA聚合酶），室温避光静置10分钟使其完全溶解，短暂离心后备用。
2. 在冰上按表3配制反应体系（总体积20μl/孔）：
- 10μl 2× qPCR Master Mix
- 2μl Primer Mix（上下游引物终浓度均为0.5μM）
- 2μl 梯度稀释的标准品或待测样本
- 6μl Nuclease-free Water
3. 将混合液轻轻吹吸混匀8-10次，避免产生气泡，短暂离心后分装至八联管中，每孔18μl。
1. 将八联管置于定量PCR仪中，设置以下扩增程序：
- 预变性：95℃ 3分钟
- 循环阶段（40个循环）：95℃ 15秒 → 60℃ 30秒（荧光信号采集）
- 熔解曲线分析：60℃至95℃，每0.5℃升温5秒
2. 运行结束后检查扩增曲线和熔解曲线，标准曲线要求R²≥0.99，扩增效率在90%-110%之间。
四、数据分析
1. 仪器软件自动生成Ct值与浓度对数的标准曲线，根据待测样本Ct值计算初始DNA浓度。
2. 若样本出现非特异性扩增（熔解曲线多峰），需重新优化引物或模板纯度。
（注意事项：所有操作需在超净台中进行，避免气溶胶污染；每次梯度稀释需更换无菌枪头。）
