免疫细胞化学染色实验的关键步骤在于抗体孵育与信号放大环节。在完成样本固定和通透处理后，需将载玻片置于湿盒中，加入按最佳稀释比例配制的一抗工作液（通常为50-100μL/片），室温孵育1小时或4℃过夜。值得注意的是，对于磷酸化蛋白检测，建议在封闭缓冲液中加入相应磷酸酶抑制剂。

 

第1阶段  样品制备和固定

 

样品的固定是 ICC 实验和储存过程中维持细胞形态的重要步骤。

 

对于盖玻片上培养的细胞

 

在此过程中，细胞在固定前直接培养在盖玻片上。

 

所需材料

 

− 标准盖玻片或多孔板

 

− 无菌PBS

 

− 用于包被的蛋白质（例如聚-L-赖氨酸）

 

− 无菌水

 

步骤

 

1. 制备包被溶液并过滤——必要时灭菌。

 

提示 ：不同的样品类型可能需要不同的蛋白质来帮助粘附。典型的包被溶液是在 PBS 中添加聚-L-赖氨酸 (PLL)、聚-D-赖氨酸 (PDL) 或明胶制备而成。请参阅文献了解您感兴趣的细胞类型和推荐的包被蛋白浓度。

 

2. 用包被溶液覆盖玻片或平板。

 

室温下孵育时间通常为1小时至24 时。

 

提示： 将盖玻片放入组织培养板的孔中，并用包被液覆盖。

 

3. 用无菌 PBS冲洗盖玻片3次。

 

提示： 这是为了确保去除盖玻片上的游离蛋白质。

 

4. 让盖玻片完全干燥。如果需要，在紫外线下消毒至少4小时。

 

警告：或者，盖玻片可以在包被之前用 70% 乙醇清洗，并在整个过程中使用无菌溶液。

 

5. 在包被的盖玻片或平板上培养细胞。

 

6. 确定细胞总数并检查细胞活力。

 

一般来说，存活率应为 90 - 95%。

 

7. 准备固定剂，并用选定的固定剂孵育细胞。

 

 

 

8. 用洗涤缓冲液清洗细胞 3 次。

 

提示：理想情况下，固定后尽快进行染色。但样品可以保存在 0.1% 叠氮化钠/PBS 中，在 4°C下保存 1-2 周。较长的储存时间可能会缓慢地逆转固定，导致形态较差和表位保存不良。

 

对于悬浮细胞

 

对于悬浮细胞，可以在将悬浮液培养到载玻片上之前洗涤并固定细胞。

 

所需材料

 

− 细胞悬液

 

− 聚苯乙烯圆底 12 × 75 mm 2 个Falcon 管/96 孔板（或任何与您的离心机兼容的容器）

 

− 悬浮液/洗涤缓冲液（例如PBS）

 

步骤

 

1. 根据厂商的指导收获和洗涤细胞。

 

2. 确定细胞总数，并检查细胞活力。

 

一般来说，存活率应为90 - 95%。

 

3. 离心，并在冰冷的悬浮缓冲液中重悬细胞样品。

 

3.1. 在4°C下以约 200 xg 离心5分钟。

 

提示：旋转时间和速度可能需要优化。

 

4. 准备固定剂，并用选定的固定剂孵育细胞。

 

 

5. 用洗涤缓冲液清洗细胞3次。

 

5.1. 将细胞离心成沉淀（200 xg，5分钟，4°C）。

 

5.2. 每次洗涤后去除上清液并重新悬浮沉淀。

 

提示：理想情况下，固定后尽快进行染色。但样品可以保存在 0.1% 叠氮化钠/PBS 中，在4°C下保存 1-2 周。较长的储存时间可能会缓慢地逆转固定，导致形态较差和表位保存不良。

 

6. 将约10 µL悬浮细胞移至载玻片上。

 

使用的最佳细胞密度取决于所使用的细胞系和实验要求。

 

此时的典型密度为 10 6 - 10 7 个细胞/mL。

 

 

 

 第2阶段 透化和封闭

 

完成样品固定后，下一步是透化细胞膜以允许抗体进入细胞内，同时减少非特异性结合。这一步骤对确保染色信号的特异性和清晰度至关重要。

 

透化步骤

所需材料：

- 透化缓冲液（如含0.1% Triton X-100的PBS）

- 封闭缓冲液（如含1-5% BSA或血清的PBS）

 

步骤：

1. 透化处理：

- 对于贴壁细胞：吸去固定后的洗涤缓冲液，加入透化缓冲液覆盖盖玻片，室温孵育5-15分钟。透化时间需根据细胞类型优化，过度透化可能导致细胞结构破坏。

- 对于悬浮细胞：离心后重悬细胞沉淀于透化缓冲液中，孵育相同时间，再次离心并洗涤。

 

2. 洗涤：用PBS冲洗样品3次，每次5分钟，以去除残留的透化剂。

 

3. 封闭：

- 加入封闭缓冲液（如5% BSA/PBS），室温孵育30-60分钟，或4°C过夜。封闭可减少抗体的非特异性吸附，提高信噪比。

- **提示**：若使用血清封闭，需选择与二抗宿主相同的血清（如二抗为山羊来源，则用山羊血清）。

 

第3阶段 抗体孵育与检测

 

一抗孵育

步骤：

1. 稀释一抗：根据抗体说明书推荐浓度，用封闭缓冲液稀释一抗。典型稀释范围为1:100至1:1000。

2. 孵育：将抗体溶液覆盖样品，室温孵育1小时或4°C过夜（后者可增强特异性结合）。

3. 洗涤：用PBS-T（含0.05% Tween-20的PBS）清洗3次，每次5分钟，彻底去除未结合抗体。

二抗孵育

步骤：

1. 避光条件下，用封闭缓冲液稀释荧光标记的二抗（如Alexa Fluor 488/594）。稀释比例通常为1:500-1:2000。

2. 室温孵育1小时，避免光照。

3. 洗涤：PBS-T清洗3次，每次5分钟。

 

核染色与封片

1. DAPI染色（可选）：用1 µg/mL DAPI溶液孵育5分钟，标记细胞核。

2. 封片：在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂（如ProLong Gold），盖上盖玻片，轻压去除气泡。避光干燥后即可成像。

 

注意事项：

- 全程避免样品干燥，否则会导致非特异性背景。

- 若需长期保存，封片后可于4°C避光存放，但建议尽快成像以防信号衰减。

 

通过以上步骤，可获得高对比度的免疫荧光图像，清晰展示目标蛋白的定位与表达水平。

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