大鼠原代视网膜微血管内皮细胞培养的方法不仅需要精细的操作技巧，还依赖于对细胞生物学特性的深刻理解。在成功分离出视网膜微血管后，接下来的步骤至关重要。
将微血管片段轻轻铺展在预先用明胶或纤维连接蛋白包被的培养皿中，这些包被物质有助于细胞贴壁和生长。随后，加入含有适当比例胎牛血清、生长因子（如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子）及抗生素的完全培养基，为细胞提供一个营养丰富且无菌的生长环境。
培养初期，需将培养皿置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中，模拟体内生理条件，促进细胞增殖。每隔两天更换一次新鲜培养基，以去除代谢产物并补充营养物质，这对于维持细胞健康状态至关重要。
大鼠原代视网膜微血管内皮细胞培养的方法不仅需要精细的操作技巧
1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；
②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；
③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；
④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；
⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；
⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。
2、细胞复苏：
①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。
②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。
3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种
①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）
②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；
③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；
④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。
大约一周后，通过显微镜观察，可见微血管片段周围逐渐长出形态均一、呈鹅卵石样排列的内皮细胞集落。此时，可利用差速贴壁法或酶消化法进一步纯化内皮细胞，去除成纤维细胞等杂质，确保细胞系的纯度。
纯化后的内皮细胞可继续扩增，用于后续的功能研究、药物筛选或疾病模型的构建。值得注意的是，整个培养过程中需严格控制无菌操作，避免污染，同时定期监测细胞形态和生长状态，及时调整培养条件，以确保实验的成功率和数据的可靠性。通过这一系列精细的操作与管理，大鼠原代视网膜微血管内皮细胞的培养将为眼科疾病研究提供宝贵的体外模型。
大约一周后，通过显微镜观察，可见微血管片段周围逐渐长出形态均一、呈鹅卵石样排列的内皮细胞集落。此时，可利用差速贴壁法或酶消化法进一步纯化内皮细胞，去除成纤维细胞等杂质，确保细胞系的纯度。
纯化后的内皮细胞可继续扩增，用于后续的功能研究、药物筛选或疾病模型的构建。值得注意的是，整个培养过程中需严格控制无菌操作，避免污染，同时定期监测细胞形态和生长状态，及时调整培养条件，以确保实验的成功率和数据的可靠性。通过这一系列精细的操作与管理，大鼠原代视网膜微血管内皮细胞的培养将为眼科疾病研究提供宝贵的体外模型。
