感受态细胞 的制备常用冰预冷的CaCl2处理 细菌 的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌.此时细菌膨胀成球形,外源 DNA 分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在 细菌 表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收.转化效率可达106-107转化子/微克DNA. 

 

    本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验操作必须在低温下进行. 

 

操作： 

 

1、取-70℃冰冻菌种,用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于37℃培养过夜. 

 

2、第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3ml LB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜.次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养约2~3小时（200~300r/min） 

 

3、当菌落600nm OD值达到0.3-0.4时,将烧瓶取出放置冰上10~15分钟.在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中.4℃,4000g离心10分钟. 

 

4、弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟. 

 

5、4℃,4000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液.加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体.每管0.2ml分装,至4℃保存备用,24-48小时内使用效果较好.如果暂时不用,可再保存于-70℃的低温冰箱中. 

 

完成分装后，为了验证感受态细胞制备的成功与否及评估其转化效率，可进行如下预实验：

 

6、取两支无菌试管，各加入0.2ml刚制备好的感受态细胞。向其中一支试管中加入适量的已知浓度和质量的质粒DNA（作为阳性对照），另一支则不加DNA（作为阴性对照）。轻轻旋转试管，确保DNA与感受态细胞充分混合，然后冰浴30分钟。

 

7、之后，将两支试管均置于42℃水浴中热激90秒，再迅速放回冰上冷却2-3分钟。这一步的热激作用是激活感受态细胞的DNA摄取机制，使其能够吸收外源DNA。

 

8、向每支试管中加入0.8ml不含抗生素的LB培养液，37℃振荡培养1小时，使细胞复苏并表达质粒上的抗生素抗性基因。

 

9、取适量培养后的菌液均匀涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养过夜。次日，观察平板上的菌落生长情况。阳性对照平板上应长出较多菌落，而阴性对照平板上则几乎没有菌落生长。若实验结果符合预期，则说明感受态细胞制备成功，且具有较高的转化效率。

 

至此，感受态细胞的制备及验证过程全部完成，为后续的实验研究提供了可靠的材料基础。

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