1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅

 

b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

 

c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

 

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

 

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

 

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

 

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。His标签蛋白纯化试剂盒样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

 

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

 

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。9. 接下来，使用75%乙醇洗涤RNA沉淀，以去除残留的异丙醇和盐类。向含有RNA沉淀的离心管中加入至少1ml的75%乙醇（用无RNA酶水配制），轻轻颠倒离心管数次以洗涤RNA沉淀，避免剧烈振荡导致RNA碎裂。

 

10. 再次进行离心，条件为2-8℃下10000×g离心5分钟。离心后，小心移除乙醇，注意不要吸走RNA沉淀。可短暂空气干燥RNA沉淀，但需注意避免过度干燥，以免RNA难以溶解。

 

11. 使用适量的无RNA酶水（通常为20-50μl，根据RNA沉淀量调整）溶解RNA沉淀。轻轻吹打或用移液器轻轻吸打几次，帮助RNA完全溶解。将溶解后的RNA溶液置于冰上，或立即进行下游实验，如反转录或RNA质量检测。

 

12. RNA质量验证：可通过电泳观察RNA条带（28S、18S和5S）的完整性，以及使用分光光度计测定RNA的浓度和纯度（A260/A280比值应接近2.0）。高质量的RNA是进行后续分子生物学实验的关键。

 

13. 若需进一步纯化或使用His标签蛋白纯化试剂盒进行蛋白纯化，请按照试剂盒的详细说明书进行，注意操作过程中的还原剂和螯合剂耐受性要求，确保实验结果的准确性和可靠性。

 

14. 最后，请妥善保存RNA和纯化后的蛋白样品，避免反复冻融，以保证其稳定性和活性，为后续实验提供可靠的材料支持。