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Ar 1193 电击感受态细胞操作方法

点击次数:391次     发布时间:2024/5/28 11:59:33

       Ar 1193电击感受态细胞操作方法,是分子生物学实验中的一项关键技术,对于基因工程、蛋白质表达等领域的研究具有重要意义。该方法通过电击的方式,将外源DNA导入感受态细胞中,从而实现基因的转化和表达。
 
    在操作前,需确保所有器具、试剂和电场设备均已消毒并处于最佳状态。感受态细胞的制备是关键步骤,需选用合适的培养基和条件,使细胞处于易于接受外源DNA的状态。制备过程中,应严格控制温度、pH值和离子浓度等参数,以保证细胞的最佳感受态。
1.0.2cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,使乙醇充分挥发,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。  
2.取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟,待其融化,加入1-5ug质粒DNA(质粒体积不大于6ul,最好用试剂盒抽提,双蒸水溶解),用手拨打管底混匀,立即插入冰中,用200ul枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中,盖上杯盖,空管保留待用。  
3.启动电转仪,设置参数:C=25uF,PC=200ohm,V=2400V(此参数为Biorad推荐,使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中,加入700ul无抗生素的LB并转移到感受态空管中,28℃振荡培养2~3小时。  
4.6000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50ug/mlkan时,28℃培养48h即可;平板中同时加入50ug/mlkan,20ug/mlrif时,需28℃培养60h;如果使用的平板含有50ug/mlrif则需要28℃培养72-90h)。 
电击转化时,需将外源DNA与感受态细胞混合均匀,然后置于电场设备中进行电击处理。电击条件的选择对于转化效率至关重要,需根据细胞类型和DNA浓度等因素进行优化。电击后,细胞需立即转移至恢复培养基中,以促进细胞的复苏和基因的表达。
在操作过程中,还需注意一些细节问题。例如,电场设备的清洁和维护、DNA的纯度和浓度、以及操作过程中的无菌条件等,都会影响转化效率和实验结果。因此,实验人员需具备扎实的专业知识和技能,以确保实验的准确性和可靠性。
 
总之,Ar 1193电击感受态细胞操作方法是一种高效、可靠的基因转化技术。通过精心准备和操作,实验人员可以获得高质量的转化细胞,为后续的基因工程研究和应用提供有力支持。
 

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