超纯RNA提取试剂盒(DNase I)实验步骤详述如下:
首先,在开启实验之前,我们需要将RNA提取液置于65℃的水浴锅中进行预热。同时,在每个离心管中加入适量的ME(巯基乙醇),具体加入量依据离心管容量而定,如10mL离心管中加入80ul,50mL离心管中加入300ul。
接着,我们取约0.8g的菌丝体。这些菌丝体可以是液体培养获得的,此时我们需要用真空抽滤的方式进行处理;若是固体培养获得的,处理过程则更为简便。然后,在液氮中迅速将菌丝体磨成精细粉末,并装入50mL离心管中。按照每1g材料加入8mL预热后的RNA提取液的比例,将提取液加入离心管中,并颠倒混匀,使菌丝体与提取液充分接触。
然后,将离心管放入65℃的水浴锅中,保持3-10分钟,期间需混匀2-3次,以确保菌丝体中的RNA能够充分溶解在提取液中。
之后,我们加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)进行抽提,离心速度为10,000rpm,温度为4℃,离心时间为5分钟。这一步的目的是去除提取液中的蛋白质和其他杂质。
接着,我们取上清液,再次用等体积的:异戊醇(24:1)进行抽提,离心条件同上。
然后,加入1/4V体积的10M LiCl溶液,将离心管置于4℃冰箱中,放置6小时以上(或过夜),使RNA进一步纯化。
随后,我们进行离心操作,离心速度为10,000rpm,温度为4℃,离心时间为20分钟。离心后,弃去上清液,用500ul SSTE溶解沉淀。
再次进行酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次,离心条件同上。这一步是为了进一步去除杂质,提高RNA的纯度。
接着,我们加入2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱中沉淀30分钟以上,使RNA沉淀析出。
然后进行离心操作,离心速度为12,000rpm,温度为4℃,离心时间为20分钟。离心后,弃去上清液,用70%酒精漂洗一次沉淀,然后干燥。
最后,加入200ul的DEPC处理水溶解RNA沉淀。至此,RNA的提取过程就完成了。
为了检测提取的RNA的质量,我们可以使用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计进行扫描检测。如果在抽提过程中发现蛋白质含量或其它杂质较多,可以适当增加抽提次数以提高RNA的纯度。