高保真快速PCR MasterMix(含红色示踪染料)CS-01F99173

产品详情

一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
高保真快速PCR MasterMix(含红色示踪染料)	Fast&HiFi PCR MasterMix	1ml\|5ml	CS-01F99173

本品包含快速高保真DNA Polymerase、dNTPs和优化的反应缓冲液，浓度为2×。使用时只需加入模板、引物，并补足水至Mix终浓度为1×即可。所含聚合酶来自于基因工程改造的pfu，大大提高了扩增速度、保真性和产量。本产品是非长片段超保真快速扩增的首选产品。本制品含红色示踪染料，不需添加上样缓冲液即可直接上样进行电泳；也可经过纯化处理，以用于酶切、连接、荧光测序等后续操作。

产品特点：

1. 扩增速度快：延伸速度可以达到2～4kb/min，是pfu的4～8倍。

2. 扩增产量高：一般PCR产物量比传统pfu产量高50%-100%

3. 优异保真性：保真度是taq的54倍以上。一般随机挑一个菌测序便是正确无突变落。

4. 扩增长度指标和pfu一致，可以完全替代pfu进行快速高保真扩增，但不建议用于pfu无法扩增的长片段。以复杂基因组DNA为模板适合扩增不超过3kb左右的产物，以简单基因组、质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增不超过6kb左右的产物。

注意事项

1.本系统扩增速度快，质粒和简单基因组等简单模版可采用15～20秒/kb,复杂模版如人类基因组可以采用30～45秒/kb。

2.对于GC含量很高的模版，预变性和变性温度可以提高到98℃，本品聚合酶耐热性强，98℃对聚合酶活性无影响。

3.如果扩增模板GC含量高或者模板复杂扩增效果不佳时，可在反应混合物中加入DMSO到终浓度1%～8%，按照1%梯度增加摸索最佳浓度。或者加入甜菜碱至终浓度1～1.7 M。并采用降落PCR(Touchdown PCR)。

储存条件：-20℃，有效期24个月。
本制品别名：2×PCR MasterMix

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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