上海莼试生物技术有限公司
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产品名称:
植物线粒体DNA提取试剂盒
型号:
CS-01F99081
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国产
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产品简介
植物线粒体DNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

 产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

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植物线粒体DNA提取试剂盒

Plant mitochondrial DNA Extraction Kit

50T|100T

CS-01F99081

介绍

 

 本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体DNA的提取制备。线粒体DNA提取的关键是尽可能的去掉核DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体,再利用DNA酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核DNA,最后得到纯净的线粒体DNA。可用于PCR等对纯度要求较高的实验。

保存条件:28℃一年,RNase ADNase I -20℃保存。使用前,在DNase I中加入600μL(50T)或者1100μL(100T)DNA酶反应液,分装后-20℃保存三个月,如果超过三个月,活性可能会降低,请自行订购DNase I。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可37℃水浴溶解,不影响使用。

操作步骤:

准备工作:在DNASE I中加入600μL(50T)或者1.1mL(100T)DNA酶反应液,适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀37℃水浴溶解,离心机温度下降到4(28),如无低温离心机,也可以常温离心,并将离心时间为10min的改为5min,但最后所得DNA品质及产量可能会有一定影响。

1.样本采集前处理:无论田间自然生长还是实验室组织培养,采摘前需避光生长2448小时,以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液,加入0.5% β-巯基乙醇,10ml植物细胞裂解液加入50μLβ-巯基乙醇,混匀,形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,此溶液可28℃保存一个月。

2.叶片用蒸馏水清洗2-3次,滤纸吸干,有条件请用液氮研磨叶片1-2克,研磨完后,取800mg左右研磨的叶片粉,加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀。如果无条件(无液氮),请预冷研钵,取洗过的叶片1000mg,用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入1.5ml预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,冰上研磨至看不见明显组织块;

3.将研磨物放置合适的离心管,4℃,1000×g 离心5min

4.将上清转移到一新的离心管中,在沉淀中加入0.5ml植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀,再次4℃,1000×g离心5min,取上清;合并两次上清,将上清4 1000×g再次离心5min

5.取上清,加入一新的离心管中,4℃,16,000×g离心10min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。

6.在线粒体沉淀中加入0.5 mL线粒体清洗液重悬线粒体沉淀,4℃,1000×g离心5min

7.取上清,加入一新的离心管中,4℃,16,000×g离心10min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;

8.加入100μL DNA酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入10μL DNASE I溶液(见准备工作),混匀,37℃水浴10min。此步为消化线粒体表面吸付的核DNA4℃,12,000×g离心5min。尽可能的弃上清,再加入200μL TE重悬线粒体沉淀,4℃,12,000×g离心5min,洗去残留的DNA酶。

9.得到的沉淀,用200μL TE缓冲液重悬线粒体沉淀,加入10μL RNase A。加入200μL线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置12min,再加入150μL蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃,12,000×g离心5min。此步骤可进一步去除核DNA

10.取上清,加入一新的离心管中(如用于酶切分析,可加入此步:选用等体积的酚氯仿异戊醇25:24:1抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可去掉一些微量蛋白及糖类,但会造成线粒体DNA的损失,因而用于PCR时可省,并不影响后续实验),加入0.6倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入2.5倍体积的乙醇沉淀DNA,如离心管太满可分两管)510μL 核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省)4℃,12,000×g离心10min

11.弃上清,再加入1ml 70%乙醇清洗,4℃,12,000×g离心5min。重复用70%乙醇洗一次。

12.弃上清,再次离心1min吸弃上清,不要碰到管底,开盖凉干约515min

13.加入20-30μL TE缓冲液,轻弹管底,37℃水浴5分钟,线粒体DNA溶解。

14.进行DNA电泳检测及-20℃保存,进行下步的实验。

注意事项:

1.以离心力g计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。

2.进行Western Blot2D-胶电泳,可直接在第7步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
3.β-巯基乙醇有毒,请注意通风及防护。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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