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产品名称:
革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒
型号:
CS-01F99080
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产品简介
革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

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革兰氏阳性菌基因组DNA提取试剂盒

Genomic DNA extraction kit for Gram-positive bacteria

50T|100T

CS-01F99080

本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,提取革兰氏阳性菌基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料,能够高效专一吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大,纯度高,质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作,包括酶切、 PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

储存条件:1525℃干燥保存,有效期12个月,2-8℃保存时间更长。

操作步骤:

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1.取细菌培养液1ml12000rpm 离心1min.,尽量吸除上清。

2.向菌体中加入200μl终浓度为20mg/ml的溶菌酶,用溶菌酶干粉加入缓冲液20mM Tris(pH8.0)2mM Na2-EDTA1.2% Triton X-10037℃处理30min以上。(如果需要去除RNA,可加入20μl RNase A,100mg/ml溶液)

3.向菌体中加入200μl溶液A,振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮,向悬浮液中加入20μlRNase A(10mg/ml)50ul溶菌酶,充分颠倒混匀,室温放置3060min(可选作,如做第3步操作,可以将第2步离心后的沉淀用于后续实验)

4.向管中加入20μl的蛋白酶K(10mg/ml),充分混匀,55℃消化3060min,消化期间可颠倒离心管混匀数次,直至样品消化完全为止,此时可见菌液呈清亮粘稠状。

5.向管中加入200μl溶液B,充分颠倒混匀,如出现白色沉淀,可于75℃放置1530min,沉淀即会消失,不影响后续实验。如果溶液未变清亮,说明样品消化不彻底,可能会导致 DNA的提取量以及纯度降低,还可能堵塞吸附柱。

6.向管中加入200μl无水乙醇,充分混匀,此时还可能会出现絮状沉淀,不影响DNA的提取,可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中,静置2min

712000rpm离心2min. 弃废液,将吸附柱放入收集管中。

8.向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)12000rpm 离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

9.向吸附柱中加入600μl漂洗液,12000rpm离心lmin,弃废液,将吸附柱放入收集管中。

1012000rpm离心2min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。

11.将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加 50200μl65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min12000rpm离心1min

12.离心所得洗脱液再加入吸附柱中,室温放置2min12000rpm 离心2min,即可得到高质量的细菌基因组DNA

注意事项:

1.样品应避免反复冻融,否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

2.若试剂盒中的溶液出现沉淀,可在65℃水浴中重新溶解后再使用,不影响提取效果。

3.如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况,可适当延长离心时间。

4.洗脱缓冲液的体积最好不少于50μl,体积过小会影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)pH值低于7.0会降低洗脱效率。DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。
5DNA浓度及纯度检测:得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1.0相当于大约50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNAOD260/0D280比值应为1.71.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响光吸收值,但并不表示纯度低。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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