上海莼试生物技术有限公司
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产品名称:
动物组织细胞DNA提取试剂盒
型号:
CS-01F99075
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产品简介
动物组织细胞DNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

 产品属性: 

产品名称

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规格

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动物组织细胞DNA提取试剂盒

Animal tissue cell DNA Extraction Kit

50|100

CS-01F99075

介绍

 

 本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统,能提取多种细胞/组织中的基因组DNA。离心吸附柱可以高效、专一吸附DNA,可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大,纯度高,质量稳定可靠。使用本试剂盒回收的DNA可适用于各种常规操作,包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤:

如非指出,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、处理材料:

a. 培养细胞:贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液(如用PBS缓冲液或类似缓冲液)10,000 g离心1分钟,倒尽上清,加入200μl缓冲液GA,振荡至彻底悬浮。

b. 组织:取约30mg动物组织(脾组织用量应少于10 mg)加入到事先盛有200μl 缓冲液GA1.5ml离心管中,用研磨杵彻底将组织研碎。

2、加入20μl蛋白酶K (20 mg/ml)溶液。

a. 提取细胞基因组时,加入蛋白酶K混匀后,55℃放置5-10分钟。

b. 提取组织基因组时,加入蛋白酶K混匀后,在55℃放置,直至组织溶解。

注:不同组织裂解时间不同,通常需1-3小时即可完成(鼠尾需要消化过夜),期间间歇颠倒混匀样品。

3、加入10μl RNaseA(10 mg/ml)溶液,混匀后室温放置2分钟。

4、加入220μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10分钟,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注:加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀,一般70℃放置一段时间后会消失。如溶液未变清亮,说明细胞裂解不彻底,会影响DNA的纯度和得率,而且可能导致步骤6中离心柱堵塞。

5、加入220μl 无水乙醇,颠倒混匀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注:加入乙醇后会产生絮状沉淀,可用枪头反复抽打1-2次将沉淀弄碎后再上柱。如果絮状物未做处理,容易导致步骤6中离心柱的堵塞。

6、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CG(吸附柱放入收集管中)11000g离心2分钟,倒掉废液,吸附柱CG放回收集管中。

注:如果出现吸附柱堵塞现象,可将离心时间延长到5分钟。

7、向吸附柱CG中加入500μl去蛋白液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)11000g离心1分钟,倒掉废液,吸附柱CG放入收集管中。

8、向吸附柱CG中加入700μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)11000g离心1分钟,倒掉废液,吸附柱CG放入收集管中。

9、向吸附柱CG中加入500μl 漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)11000g离心1分钟,倒掉废液。

10、将吸附柱CG放回废液收集管中,11000g离心2分钟。

注:此步骤非常重要,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR)实验。

11、将吸附柱CG转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,11000g离心2分钟。

注意:

a.洗脱缓冲液体积最好不少于100μl,体积过小影响回收效率。

b.洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内,pH值低于7.0会降低洗脱效率。

12DNA产物-20℃保存。
储存条件:室温,有效期12个月。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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