实验前准备及重要注意事项：

1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 储存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2、获得样品后，要尽快将样品在4%-10%的福尔马林中固定，固定时间以14-24小时为宜，时间过长易导致基因组断裂，影响下游实验。

3、确保包埋前的样品彻底脱水，残留的福尔马林会抑制蛋白酶K 的作用。

4、第一次使用前应按试剂瓶标签说明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。

5、使用前请检查Buffer GTL和Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GL和Buffer GTL于56℃水浴重新溶解。

6、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在加入Buffer GL前加入4μl DNase-Free的RNase A(100 mg/ml)，RNase A本试剂盒并未提供，如果需要可单独向本公司订购，货号：WE0225S。

操作步骤：

1、样本处理：

a. 石蜡包埋样本：用手术刀将组织块中多余的石蜡修剪掉，露出组织。

b. 福尔马林等固定液中的样本：取约20 mg的样本，切成小块，置于离心管中，加入500μl 10mM PBS(PH7.4),涡旋振荡，12000rpm(～～13400×g)离心1分钟，重复3次，可直接进行第7步操作。

2、将组织块切成5-10μM的薄片。

注意：如果样品表面已经暴露在空气中，请将接触空气的2-3片弃掉不用。

3、取约1×1cm2的切片(共约4-5片切片)置于离心管(自备)中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒。

4、12000rpm离心2分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

5、加入1ml无水乙醇，涡旋震荡混匀。12000rpm离心2分钟，弃上清，注意不要吸弃沉淀。

注意：乙醇可以除去样品中残余的二甲苯。

6、打开管盖，室温或最高至37℃孵育10分钟，直至无乙醇残留。

7、加入180μl Buffer GTL，重悬沉淀；加入20μl 蛋白酶K ，涡旋震荡混匀。

8、56℃孵育1小时，直至样品完全溶解。90℃孵育1小时。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1)此步骤的目的是修复由甲醛变性的核酸，孵育的温度过高或时间过长可能造成DNA断裂，产生DNA碎片。

2)56℃孵育后的样品可置于室温，直至水浴锅或干浴锅温度达到90℃后再把样品置于90℃孵育。

3)如需除去RNA，可将样品温度降到室温后，加入4μl浓度为100 mg/ml 的RNase A溶液，震荡混匀，室温放置5-10分钟。

9、加入200μl Buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。加入200μl无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

注意：

1)加入Buffer GL和无水乙醇后要立即充分混匀。

2)如果需要对多个样品进行操作，可以将Buffer GL和无水乙醇事先混匀后加样。

10、将步骤9所得溶液全部加入已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

11、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

12、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

13、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟以彻底晾干。

注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应(酶切、PCR等)。

14、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入20-100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

注意：

1)如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。

2)离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。

3)用另外的20-100μl Buffer GE或灭菌水再次洗脱可以增加产量。

4)如果要提高DNA的终浓度，可以将步骤14所得的DNA洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤14；若洗脱体积小于100μl，可以增加DNA的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1μg，推荐用20μl Buffer GE或灭菌水洗脱。

5)因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer GE洗脱并于-20℃保存。储存条件：室温(15～30℃)。