实验前准备及重要注意事项：

1、向蛋白酶K中加入指定用量(1.25mL)的蛋白酶K储存液使其溶解，使其浓度为20mg/mL。配制好的蛋白酶K -20℃保存，勿长时间室温放置，以免影响其活性。其他组分可以在干燥、室温(15～25℃)环境下稳定保存一年。如需保存更长时间，可置于2～8℃。

2、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

3、第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。

4、使用前请检查Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，请将Buffer GL于56℃水浴重新溶解。

5、如果下游实验对RNA污染比较敏感，可以在第3步中加入4μL DNase-Free的RNase A(100mg/mL)，RNase A本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购，货号：WE0225。

6、若要在室温下长时间保存唾液DNA，推荐使用唾液DNA保存液。

操作步骤：

1、加入唾液样本或唾液/保存液混合液400μL。

【注】：

● 加入保存液的唾液混合物需在提取前50℃水浴1小时或50℃空气温箱2小时。

● 如需要增加样本体积，则倍比增加步骤2-4中的蛋白酶K、Buffer GL和无水乙醇的体积，步骤5中液体可分多次转入。

2、加入40μL蛋白酶K。

3、加入400μL Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，56℃水浴15～30分钟。

【注】：

● 如需去除RNA，可在上述步骤完成后，加入4μL浓度为100mg/mL的RNase A溶液，涡旋15秒，室温放置2分钟。

4、短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入400μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。短暂离心。

【注】：

● 加入Buffer GL和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

● 加入Buffer GL和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。

● GL和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。

5、上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm(～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6、向吸附柱中加入500μL Buffer GW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μL Buffer GW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

【注】：

● 如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。

8、12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

【注】：

● 这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。

9、将吸附柱置于一个新的离心管(自备)中，向吸附柱的中间部位悬空加入50～200μL Buffer GE或灭菌水，室温放置2～5分钟，12000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

【注】：

● 如果下游实验对pH值或EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5(可以用NaOH将水的pH值调到此范围)，pH值低于7.0时洗脱效率不高。

● Buffer GE在65～70℃水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量。
● 因为保存在水中的DNA会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用Buffer