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产品名称:
M13噬菌体单链DNA提取试剂盒
型号:
CS-01F99036
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产品简介
M13噬菌体单链DNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

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M13噬菌体单链DNA提取试剂盒

M13 phage single strand genomic DNA rapid extraction kit

50|100|200

CS-01F99036

M13和其它的丝状噬菌体载体,在文库构建和为序列测序提供单链DNA和引人突变方面十分有用。将适量M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物离心,上清中的单链噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,将盐、细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净噬菌体单链DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点:

不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。

节省时间,简捷,单个样品操作一般可在10分钟内完成。

产量高,典型的产量800μL M13丝状噬菌体上清可以提取3μg噬菌体单链DNA

多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.71.9。可以直接用来测序,一般典型可辨认读长达650bp

保存事项:

本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

结合液MB低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

注意事项:

所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。

开始实验前将需要的水浴先预热到50℃备用。

结合液MB含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

操作步骤:

800μL噬菌体感染细菌培养上清提取举例,第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!

M13丝状噬菌体或者相关噬粒(M13来源)感染的液体培养物分装在1.5毫升离心管,12000rpm离心5分钟沉淀菌体。

小心取800μL上清转入新的1.5mL离心管,加入400μL结合液MB,充分混匀。

注:如果使用的上清大于或者小于800μL,则结合液MB的用量需要按照比例增加或者减少。

将上述混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心15秒,倒掉收集管中的废液。

注:吸附柱一次最多只可以容纳大约700μL混合物,因此需要分次把混合物加到吸附柱内,重复步骤3

加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心30秒,弃废液。

将吸附柱AC放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加60μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在50℃水浴中预热),室温放置1分钟,12000rpm离心1分钟。如果想得到较多量的DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,10000rpm离心1分钟。

注:洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于40μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。

 

DNA可以存放在28℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:M13噬菌体单链DNA提取试剂盒 50次 100次 200次 

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