上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 痰液DNA提取试剂盒
产品名称:
痰液DNA提取试剂盒
型号:
CS-01F99026
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国产
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产品简介
痰液DNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

 产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

货号

痰液DNA提取试剂盒

Sputum DNA extraction kit

50

CS-01F99026

介绍

 

 痰液是重要的检测样品,可以用于诊断肺癌,肺结核等各种疾病。但是从痰液中纯化DNA十分棘手,为此本公司开发了本产品,专用于从痰液或其他上呼吸道分泌样品中纯化DNA,用于后续的分子生物学分析。

产品特点:

1. 每次可以处理10-20mL痰液,得到2-5μg DNA

2. 纯度高,可直接用于后续得PCR检测。

3.一管式操作,减少污染,节约成本。

4.含痰液保存液(溶液A),便于取样和运输。

5. 无毒环保,不需要使用苯酚和氯仿等有毒的有机溶液。

储存条件:常温运输和保存,有效期一年。

使用方法:

一:痰标本的获取与保存(注意:痰液以及下列操作的废弃液都可能含有致病性的结核杆菌等致病菌,需按传染源相关规定流程进行操作)

1. 每例患者在常规痰标本采样时,最好连续三天采集三次样品以防误差。具体做法是先在每个50mL的痰液收集管内新鲜加入10mL溶液A10mL溶液B,待患者晨起漱口后,咳深部痰78(10-20mL),收集到装有溶液A和溶液B混合液的痰液管收集内,混匀后储于4℃冰箱或阴凉处。第二、三天重复此操作。取足三管后一起送实验室,4℃冰箱保存直到使用。

2. 使用时,在室温反复振摇装有样品(总体积约30-40mL)的痰液收集管510分钟,充分混匀直到痰液中无粘稠痰块而呈均匀的液相。

3. 42500g离心5分钟,弃上清。

4.沉淀再用自备的PBS液洗两遍。

5. 所得沉淀可以直接用于涂片,用于比较细胞形态学分析。也可以将细胞沉淀在0.2mL PBS缓冲液中重悬后转入1.5mL螺旋盖塑料离心管,-20℃冰箱长期保存,或立即用于下步的DNA提取。为避免盖子崩开而出现交叉污染或痰液的分枝杆菌污染环境,建议不要使用压盖式塑料离心管。同时最好设置一个阳性和一个阴性对照。

二:DNA提取

6.在上步所得的0.2mL样品中加入0.6mL溶液C。溶液C容易形成沉淀,用前需37℃加热融化并摇晃均匀。

7.室温放置10分钟。此间可以在每个管外壁上做个标记,以在下步区别向心面和离心面。

8. 振荡数秒后加入0.7mL自备的异丙醇,旋紧盖后振荡30秒混匀。

9. 把离心管的向心面对向转头,13,000-15000g室温离心至少15分钟。

10.小心移弃上清,注意不要触及管底和管壁离心面的DNA沉淀(此时可能看不见)

11. 加入1.0mL 70%乙醇,振荡数秒后 15000g室温离心5分钟。注意:在离心机中放置离心管时将其向心面对向转头的中央。

12.小心移弃上清,注意不要触及管底和管壁离心面的DNA沉淀(此时呈膜状沉淀)

13. 将离心管放回离心机再短暂离心数秒,然后用移液器移弃约50μL残留液体(70%乙醇),否则它会影响后续反应。

14. 加入200μl RNase-free水,用移液枪仔细吹打离心管管底和管壁离心面的膜状DNA沉淀,溶液将呈混浊状,含少量不溶,短暂离心后存上清(DNA)
15. 直接取适量用于PCR,样品使用量不超过PCR体系的1/2。剩余DNA样品可以室温放置2小时,也可保存于-80℃保存一个月。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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