产品特点：

即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。

两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，基因组DNA污染少。

本产品可以用15次，一次可以处理约1×108个培养细胞（相当于5瓶150mm培养细胞），可以纯化到到0.2～0.5mg线粒体。

适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。

提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。

运输及保存：

常温运输和保存，保存期限一年。其中有3个成分（见上表）放低温成分袋，低温运输，-20℃保存。

自备试剂：

PBS缓冲液、氯仿、0.5M EDTA溶液（pH8.0）。

人TPMT VNTR的上游引物为5 GCT CCG CCC TGC CCA TTT 3，

人TPMT VNTR的下游引物为5 GCC TCC GCC ACC AAT GAC 3，

人线粒体HV2区的上游引物为5 GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C3，

人线粒体HV2区的下游引物为5 CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A3。

使用方法：

注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或冷室进行，溶液和离心管都需预冷。

一、准备工作

未用完的下列溶液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前需溶解沉淀并摇匀。

将50mL溶液A和250mL溶液B放冰上预冷待用。

配制1.0M低比重溶液100mL:将34克蔗糖用100mL溶液B溶解并放冰上待用。

配制线粒体重悬液100mL:将75mL溶液B和25mL1.0M低比重溶液混合，冰上待用。

二、线粒体粗提

如果提取材料是单层培养细胞，先用20mL自备的PBS缓冲液洗涤1×108个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则1000g 4℃离心10分钟收集1×108个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，*后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。

用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000g 4℃离心10分钟，弃上清留沉淀。

加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的溶液A，轻柔重悬细胞。

冰上放置4～5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。

如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20～30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。

将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10～15mL，间隙为0.12mm，*好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其*适匀浆次数不同，一般需要40次～60次左右。匀浆是线粒体纯化*关键的步骤，故匀浆前*好先通过预实验确定*适匀浆次数，方法是每匀浆5～10次后，取2～3μL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。

加入1/3体积的、预冷的1.0M低比重溶液，轻柔混匀。

用平甩转子离心机4℃1000g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。

转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃15000g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。

用5mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃15000g离心15分钟，弃上清。

重复上步一次。

如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第4部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。

三、细胞核DNA的去除及鉴定

将线粒体重悬于0.3mL预冷的线粒体重悬液中，取10μL作为未处理线粒体（后面将使用）。

加入6μL Benzonase（1U/uL）溶液和30μL DNase A溶液（配法：将0.5mL 10×DNase A反应液加到装有5mg DNase A干粉的离心管中得到10mg/mL DNase A溶液，未用完的此溶液需要分装后放-20℃保存）。

37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：*好先预实验，每隔一段时间取10μL样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增人基因组TPMT VNTR位点和人mtDNA HV2区(两基因的PCR引物见自备试剂)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为*佳。相关引物和PCR试剂需要自备。可用未处理线粒体做对照。

加入10μL自备的0.5M EDTA溶液（pH8.0）以终止酶反应。詹纳斯绿B染色并在显微镜下检查线粒体完整性（操作见上）。

4℃10000g离心10分钟，弃上清。
用1mL的预冷线粒体重悬液重悬线粒体后，4℃10000g离心10分钟，弃上清留沉淀。