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分子生物学试剂 > DNA提取纯化 > 柱式分枝杆菌DNA提取试剂盒
产品名称:
柱式分枝杆菌DNA提取试剂盒
型号:
CS-01F99002
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国产
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产品简介
柱式分枝杆菌DNA提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

 产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

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柱式分枝杆菌DNA提取试剂盒

Mycobacteria DNA column extraction kit

50

CS-01F99002

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类极为古老的革兰氏阳性细菌属,它具有不同于别的细菌的细胞壁结构,其靠近细胞膜的部分是其他革兰氏阳性细菌都具有的肽聚糖(peptidoglycan)层,该层通过磷酸二酯键与分枝酸-阿拉伯半乳糖-肽聚糖复合层(MAPc)共价连接。分枝酸是含7090个碳原子的枝链脂肪酸,位于MAPc的外层,分枝杆菌因此而得名。MAPc层之外为糖化脂质层(glycolipid),它与分枝酸相连,成分主要是磷脂,占细胞壁干重的比例高达60%,所以分枝杆菌疏水性很强,不能使用革兰氏染色。分枝杆菌细胞壁还含有贯穿整个细胞壁的脂阿拉伯糖甘露聚糖(LAM),它是一种含阿拉伯糖和甘露糖的磷酸化的、不均一混合物,其末段所连接的成分的不同与细菌对巨噬细胞反应的不同密切相关。分枝杆菌细胞壁的上述特点使得用常规方法纯化其DNA非常困难。本产品就是为解决这一问题而开发的产品。

产品特点:

操作简单,客户不需要准备额外的试剂。

适用于整个分枝杆菌属。

获得的基因组DNA足够进行后续的核酸扩增或酶切处理。PCR检测灵敏度一般在10-100 CFU/mL样品。

既可以使用培养的分枝杆菌,也可以使用从痰液、精液、血液、脑脊液等样品中分离的分枝杆菌。

安全无毒,本试剂盒对人体无害,无腐蚀性和刺激性气味。

本产品只能用于科研。

自备试剂:

TE缓冲液,氯仿。

使用方法:

注意:文献报道部分分枝杆菌在DNA提取过程中还有形成菌落的能力,所以任何丢弃的溶液都必须按有传染性的污染物品对待,并严格按有关要求进行消毒处理。

一、培养的分枝杆菌样品的预处理

刮取培养皿培养的分枝杆菌到0.5mL自备TE缓冲液中。

80℃放置20分钟以杀灭分枝杆菌。

3000g室温离心15分钟,弃上清。

将分枝杆菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入到第四步的分枝杆菌基因组DNA提取步骤。

二、含分枝杆菌的痰液样品的预处理

将痰液样品(0.5mL2mL)加入到干净的10mL15mL塑料离心管中。

2mL的自备蒸馏水,再加入100mg化痰液干粉,充分混合均匀后室温放置1530分钟。如果痰很浓,可以延长保温时间30分钟。

3000g室温离心15分钟,弃上清。

将分枝杆菌沉淀放-20℃冰箱备用或直接进入到第四步的分枝杆菌基因组DNA提取步骤。

三、含分枝杆菌的血液样品的预处理

用自备红细胞裂解液对血液进行红细胞裂解处理(可另购本公司红细胞裂解液产品)。

将得到的白细胞沉淀放-20℃或更低温度放置10分钟。

迅速将得到的白细胞沉淀100℃加热10分钟。

重复上步的洗涤过程一次。

短暂离心半分钟。此步不要省略,否则残留的洗柱液(含乙醇)将会影响DNA电泳、酶切和PCR等反应。

将离心吸附柱转移到一新的离心管中,加入50μL DNA洗脱液2.01200015000g室温离心半分钟,所得溶液即分枝杆菌基因组DNA
直接取510μL电泳检测DNA,其余放冰箱备用或用于后续反应。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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