E-64(蛋白酶抑制剂)CS-01F98974_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
E-64(蛋白酶抑制剂)	(L-3-trans-carboxyoxirane-2-carbonyl)-L-Leucylagmatine Hemihydrate	1mg\|5mg\|10mg\|25mg\|50mg	CS-01F98974

介绍

E-64是一种不可逆的、效的、高选择性半胱蛋白酶抑制剂。E-64不与非蛋白酶的功能性硫醇基团反应，如L-乳酸脱氢酶或肌酸激酶。与亮抑酶肽和抗蛋白酶肽等其他半胱蛋白酶抑制剂不同，E-64不会抑制丝蛋白酶（除外）。E-64的反式环氧琥珀酰基（活性部分）不可逆地与许多半胱蛋白酶的活性巯基结合，如木瓜蛋白酶、猕猴桃酶和组织蛋白酶B、H和L，从而形成硫醚键。E-64是一种非常有用的半胱蛋白酶抑制剂，具有特异性抑制作用，在细胞和组织中具有渗透性，毒性低。

E-64是亲和纯化半胱蛋白酶的有效配体。当与硫醇化亲和基质偶联时，结合将成为可逆的，但保留了特异性。

E-64可溶于水。可配制成20mg/ml的水溶液（可能需要加热）。建议储备溶液是1mM水溶液。用作蛋白酶抑制剂的有效浓度为1至10μM。水溶液储备溶液可在-20℃稳定保存数月。稀释液可在中性pH体系中稳定保存数天。E-64在pH 2-10体系中稳定，但在氨水或HCl体系中不稳定。E-64也溶于DMSO，可使用无水DMSO制备10 mM溶液并储存在-20℃。使用培养基进行后续稀释。将E-64溶解在0.9％氯化钠溶液中或溶解在少量的饱和溶液中并用0.9％氯化钠稀释（用乙酸调节pH至7.0），可制备注射液。

CAS号：66701-25-5

InChI Key：LTLYEAJONXGNFG-HBNTYKKESA-N

经验分子式：C15H27N5O5

分子量：357.41
保存条件：2-8℃

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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