上海莼试生物技术有限公司
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分子生物学试剂 > 蛋白质研究 > 包涵体蛋白提取试剂盒
产品名称:
包涵体蛋白提取试剂盒
型号:
CS-01F98932
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国产
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产品简介
包涵体蛋白提取试剂盒现货供应,价格实惠。
产品详情

一、概述:

 产品属性: 

产品名称

英文名称

规格

货号

包涵体蛋白提取试剂盒

Inclusion Body Protein Extraction Kit

10T|30T

CS-01F98932

本试剂盒用于提取表达蛋白质的不溶性聚集体——包涵体蛋白和筛选克隆大肠杆菌在包涵体中表达的重组蛋白。提取过程简单快捷。溶解的蛋白质可用于后续实验,如重折叠,SDS-PAGEWestern Blots2-D凝胶电泳酶分析。

保存条件:

DNase I,,2×SDS loading buffer100×Protease Inhibitor保存在-20℃,其他组分保存在常温(如开封后建议保存在4℃),保质期24个月。

规格说明:

10T包装的本试剂盒可用于10X 1g湿重大肠杆菌或10X 1L大肠杆菌培养物(OD600= 1)

注意事项:

4℃下进行步骤1和步骤2

不同蛋白可能需要不同的步骤,成功重折叠的变性蛋白质可以完全依赖于步骤进行,几种技术如稀释,透析和凝胶色谱法可用于重折叠变性蛋白质。对其他重折叠蛋白的步骤,请参见参考文献。对于不同蛋白使用相差显微镜来检测大肠杆菌是否彻底裂解,因为完整的细胞会降低蛋白质的纯度。

虽然蛋白质存在于包涵体中,但在某些情况下上清中仍然有大量的蛋白质,因此可以检测上清液。

6M盐酸胍代替尿素,可以得到更好的效果

使用GSH/GSSG系统和分子伴侣,配体,底物等小分子能够提高复性产率。
处理100×Protease Inhibitor时需要小心操作,佩戴防护眼镜和手套,因为其对健康有害,毒性非常大,对眼睛和皮肤有刺激性作用。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:包涵体蛋白提取试剂盒 10T 30T 

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