免疫沉淀试剂盒(Protein G琼脂糖)CS-01F98929_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
免疫沉淀试剂盒(Protein G琼脂糖)	Immunoprecipitation Kit,Protein G Agarose	20次	CS-01F98929

介绍

免疫沉淀可以通过特异性抗体和结合抗体的基质，从复杂的蛋白混合物中特异性的纯化蛋白质，然后可以通过离心从混合物中分离出经特异性抗体结合蛋白的基质。本试剂盒使用的基质是琼脂糖结合Protein G。IP之后是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），IP常用于测量蛋白质抗原的分子量，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，测定特异性酶活性，监测蛋白质表达后的修饰，确定蛋白质的存在和数量等。IP技术还能够检测罕见的蛋白质，因为IP可以将其浓缩至高达10000倍，一般方法难以检测。

试剂盒特点：

为准备细胞/组织提取物，抗原结合，洗脱步骤提供优化的缓冲液。

试剂盒中提供的Protein G琼脂糖beads可以广泛、更地结合更多类型的IgG，多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，Protein G还可以和某些抗体的Fab和F (ab')2段结合。

可用于功能性实验，例如蛋白质或者蛋白质复合物的IP/Co-IP。
保存：Protein G-琼脂糖需要在4℃保存，不可冻存。PMSF和1×上样缓冲液需要在-20℃保存，其他产品保存在室温即可，保质期24个月。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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