亚细胞结构蛋白提取试剂盒CS-01F98732_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
亚细胞结构蛋白提取试剂盒	Subcellular Structure Protein Extraction Kit	50次	CS-01F98732

概述

本试剂盒是专门针对从各种动物细胞中快速高效地抽提分离不同亚细胞蛋白质组份而设计的。运用含有不同去污剂的抽提试剂，按照亚细胞结构对动物细胞进行有序的抽提，可将细胞内的蛋白依次分离成四部分，分别是：胞浆蛋白、细胞膜和细胞器膜蛋白、核蛋白、细胞骨架（微丝和中等纤维）蛋白和核基质蛋白。可广泛运用于各种相关的细胞生物学实验，如蛋白质（酶）的亚细胞定位、内（外）源性因子亚细胞定位以及在细胞骨架网络中的作用。本试剂盒每次可以从5×106悬浮或贴壁培养的细胞中提取几乎所有蛋白质，可以使用50次。

储存条件：按标签提示分开储存

特点

每次可以从5×10^6悬浮或贴壁培养的细胞中提取几乎所有蛋白质；

提取的蛋白绝大多保持原有活性和完整性；

根据不同蛋白质在不同去污试剂中溶解能力的不同，将细胞中的蛋白质有顺序地提取，可以增加蛋白质的提取效率和蛋白质的点数；

整个实验过程只需要2h左右。

应用分离得到的各蛋白组份可直接用于1D和2D电泳分析、Western Blot分析、酶活测定和蛋白定位研究等。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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