一步法细菌活性蛋白提取试剂盒CS-01F98705_上海莼试生物技术有限公司

产品详情

一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
一步法细菌活性蛋白提取试剂盒	One Step Bacterial Active Protein Extraction Kit	20次	CS-01F98705

本产品采用一种温和的非离子型去污试剂并可以通过透析去除，可破裂细菌细胞，溶解蛋白而不会是蛋白变性，可从大肠杆菌中提取可溶性蛋白，不需要声等机械细胞破碎方法，可以从细菌裂解液中提取可溶性蛋白和回收包涵体蛋白，而且提取效率要高于声等机械细胞破碎方法，该产品提供的Lysozyme和DNase I两种组分可以提高分子量大于60kDa的可溶性蛋白和蛋白包涵体洗涤沉淀回收效率，提取的可溶性蛋白可以直接用于电泳，免疫共沉淀，蛋白质绞链，标记，Pull Down，EMSA，酶免分析(Western blot、ELISA、RIA)等实验。可以使用20次。

产品特点：

可以在20min内完成对细菌可溶性蛋白的提取；

该产品可以同时实现可溶性蛋白提取和蛋白包涵体洗涤沉淀回收；

提取的可以溶性蛋白可以直接用于电泳，免疫共沉淀，蛋白质交链，标记，Pull Down和EMSA等实验；

提取的蛋白质可以透析去除非离子型去污试剂或将缓冲液替换为所需要的目的蛋白质的合适缓冲液；

可以按照需求按比例扩大提取的菌体的量，比较合适于重组蛋白的快速筛选。
保存：于2～8℃，其中Lysozyme，DNase I，DTT，PMSF需置于-20℃保存，有效期两年。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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