Bradford蛋白定量试剂盒CS-01F98676_上海莼试生物技术有限公司

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
Bradford蛋白定量试剂盒	Bradford Protein Assay Kit	50次微管检测/500次微板检测	CS-01F98676

本试剂盒是根据考马斯亮蓝G-250（Coomassie Brilliant Blue G）法研制而成，实现了蛋白浓度测定的快速，稳定和高灵敏度，其原理是考马斯亮蓝G-250可以在酸性条件下和蛋白质结合产生特殊的蓝色，大吸收波长在595nm处。染色反应可在5-10分钟内完成，颜色能保持30分钟稳定，因此可通过比色分析在几分钟内快速测定蛋白质含量。本试剂盒含有配制好的考马斯亮蓝溶液和牛血清白蛋白（BSA）溶液作为蛋白质标准溶液，测定范围为50-1000μg/ml。

产品特点：

•快速方便：即开即用，操作简便。

•灵敏准确：测定范围是50-1000μg/ml（595nm读数），可检测25 μg/ml的蛋白质，在测定范围内有较好的线性关系，变异系数小。

•兼容性广：与其它蛋白浓度测定方法（如Lowry法）相比，该方法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中的DTT浓度可高达5mM，但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween-20，60和80低于0.06%，使用微板法测定时将体积按比例减小。
保存条件：考马斯亮蓝染液4℃避光保存。牛血清白蛋白（BSA)溶液-20℃保存。

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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