产品属性： | 产品名称 | 英文名称 | 规格 | 货号 |
| 无蛋白封闭液 | | 500ml | CS-01F98522 |
在WB和ELISA 实验中，需要用封闭试剂将膜或酶标板孔中的未被抗原或抗体占据的位点进行进行封闭，通常的封闭试剂有BSA，脱脂奶粉等，但是BSA中有少量的抗体残留，导致抗原/抗体之间的交叉反应，产生高背景，杂带较多或使得本底水平增高，同样脱脂奶粉中含有少量的和碱性磷酸酶残留，在使用-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时，也会使得高背景或本底水平增高，脱脂奶粉中含有的酪蛋白和碱性磷酸酶残留也使得其不适用于磷酸化蛋白的检测。
| 无蛋白封闭液产品采用化学合成的高分子聚合物，作为封闭试剂，从而避免了BSA，脱脂奶粉作为封闭试剂的缺陷，使得实验的结果更加精确，膜上的条带更加清晰，同时也不降低免疫印迹反应的灵敏度。 储存条件：2-8℃保存。 有效期：一年。 注意事项： ● 背景非常高的抗体，可以4℃封闭过夜。 使用方法： 1．WB 实验时，将封闭液加入到合适的含有膜的容器中，将膜完全浸没，在室温或37℃条件下，震荡1-2小时。 2．ELISA 实验中，将200μL封闭液加入到酶标板的每个孔中在室温或37℃条件下，震荡1-2小时。
3．按照Western blot和ELISA 实验的要求，继续进行洗涤或甩板，一抗，二抗的加入，洗涤，显色或发光等其他实验。 |
实验步骤：
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c．细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
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