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Lowry蛋白定量试剂盒 | | 250T|1000T | CS-01F98508 |
在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物,Folin-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐被复合物蛋白质中的酪和苯丙残基还原,产生深蓝色,在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正比,可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。
储存条件:试剂A、B和Folin-Ciocalteu试剂4℃保存。蛋白标准-20℃保存。
有效期:一年。
使用方法: A、96孔酶标板测定: 1.工作液C配制。根据样品数量,按50体积试剂A加1体积试剂B(50:1)配制适量工作液C,充分混匀。 2.标准曲线绘制。 3.加入Folin-Ciocalteu试剂振荡混匀后,室温放置30分钟。 4.用酶标仪测定A750,以不含BSA的光吸收值为空白对照。 5.以蛋白含量(μg)为横坐标,吸光值为纵坐标,绘出标准曲线。 6.样品测定:将待测蛋白样品用去离子水稀释至适当浓度,取20μl样品,加入200μl 工作液C,混匀后室温放置10分钟,然后加入20μl Folin-Ciocalteu试剂,混匀后室温放置30分钟。 7.以 0 号孔为对照,测定样品吸收值A750。 8.根据测得的吸收值,在标准曲线上即可查得样品的蛋白含量。 9.计算蛋白浓度:以查得的蛋白含量除以样品体积20μl,再乘以相应的稀释倍数即可得到待测样品的实际浓度。 B.比色皿测定 按照比色皿规格,与以上方法相同,适当按比例增加各溶液体积即可。 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。