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分子生物学试剂 > 蛋白质研究 > 牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg)
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牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg)
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CS-01F98220
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牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg)现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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牛凝血酶(高活力,>2000 IU/mg)

Bovine Thrombin

1KU|2KU

CS-01F98220

凝血酶是由大小分别为31KD6KD的两条肽链通过二硫键组成的一种丝蛋白水解酶,可从动物血浆中利用已激活凝血酶原水解制得,可催化纤维蛋白原(fibrinogen)水解释放A肽和B肽,由此形成纤维蛋白单体,单体进一步聚合,在血小板、红细胞和白细胞等参与下形成血凝块,常用于诊断学中凝血化验、检测、血液或血浆的脱纤维化等;另外,由于凝血酶切割序列专一,水解效率高,因此在分子生物学、生物化学或生物工程制药研究中也常作为工具酶用于重组融合蛋白(包含凝血酶识别位点)的特异性断裂。

本品是从牛的血浆纯化制得,具有纯度高、比活高、不含有其他蛋白酶活性、灭活病毒、生产稳定性好等特点。该酶适切割位点:A-B-Pro-Arg--X-Y (其中,AB为疏水氨基酸,XY为非酸性氨基酸),常见的识别序列为:1. Leu-Val-Pro-Arg--Gly-Ser2. Gly-Arg--Gly

英文别名:Coagulation factor II

CAS9002-04-4

分子量:37KD

比活度:>2000 IU/mg protein

外观:冻干粉末

纯度:SDS-PAGE检测图谱无杂蛋白条带

湿度: 5% w/w

使用方法(切割体系)

本品有效切割质量比1:2000,通常在未做过预实验的情况下建议在1:1000质量比进行体系的优化,即1mg的目的蛋白加入2U的酶(2000U/mg),使用时可用生理盐水将酶配成100U/ml ,有效消化缓冲液:20mM Tris-HCl,含150mM NaClpH8.0。在20-37℃切割0.3-16h

【注】:

具体反应温度可根据融合蛋白的性质而定,如需要低温保存的蛋白,可在4℃切割24h

因为凝血酶会吸附在玻璃上,建议用塑料管分装冻存(-20℃)凝血酶溶液。
储存条件:4℃,有效期36个月。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

标签:牛凝血酶(高活力 >2000 IU/mg) 1KU 2KU 

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