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产品名称:
重组烟草蚀纹病毒蛋白酶
型号:
CS-01F98219
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产品简介
重组烟草蚀纹病毒蛋白酶现货供应,价格实惠。
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一、概述:

产品属性: 

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重组烟草蚀纹病毒蛋白酶

rTEV Protease

1000U

CS-01F98219

重组型TEV蛋白酶(rTEV)是经过基因工程改造和纯化后的重组蛋白酶,不仅保持天然TEV酶的功能活性,且在广谱的温度范围内表现出更好的稳定性和特异性。rTEV是一种用来切除融合蛋白上亲和标签的常用工具酶,具有很的位点特异性,严格识别七氨基酸序列EXXYXQ(G/S),切割位点在和甘/丝之间。普遍应用的七氨基酸序列为:Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-GlyrTEVpH7.030℃时可达到佳活性,但在pH6.0-8.5和温度4-30℃的广泛范围内皆有活性(见表1),使得反应条件的选择可根据目的蛋白的情况而灵活变动。另外rTEV切割后也能利用其N端的6×His标签,通过Ni-NTA树脂去除,以达到纯化目的蛋白的目的。

影响天然TEV酶活性的常见因素:1PMSFAEBSF1mM),TLCK1mM),Bestatin1mg/ml)、Pestatin A1mM),EDTA1mM)以及E-643mg/ml),以上这些蛋白酶抑制剂对rTEV的活性没有影响;2Zn离子(>5mM)对rTEV活性有抑制;3)与半胱反应的试剂也是rTEV的潜在抑制剂。

来源:大肠杆菌

外观:无色透明液体

比活力:5U/μl

活性定义:在1×rTEV Buffer50mM TrispH8.00.5mMEDTA1mMDTT)中,30℃反应1h,剪切>85%3μg底物所需要的酶量定义为一个活性单位。

纯化(Purification):Ni亲和纯化

纯度:≥95%by SDS-PAGE

产品组份:

rTEV Protease5U/μl)—————200μl

rTEV Buffer 120×)——————2ml

rTEV Buffer 21000×)—————50μl
储存条件:-20℃,有效期一年。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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