人源红色荧光标记氧化型低密度脂蛋白CS-01F98170

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一、概述：

产品属性：

产品名称	英文名称	规格	货号
人源红色荧光标记氧化型低密度脂蛋白	Human DiI-Oxidized Low Density Lipoprotein (Human DiI-Ox-LDL)	500μg	CS-01F98170

我司提供的Human DiI-Ox-LDL为无菌包装，可以直接稀释使用。除提供DiI-Ox-LDL，我们还提供不带标记的Ox-LDL，Ac-LDL（乙酰化修饰）以及不经修饰的LDL等。

LDL是由极低密度脂蛋白（VLDL）转变而来，主要功能是把运输到全身各处细胞，运输到合成酸，其可用于研究受体介导的内吞作用过程，尤其是在动脉粥样硬化等疾病中，其血浆来源的LDL可用于研究LDL在功能和代谢中的氧化作用。

氧化的LDL（Ox-LDL）是修饰LDL中的一类。修饰的LDL除包括氧化修饰的LDL外，还包括乙酰化LDL及丙二醛（MDA）、4-羟烯酸（4-HNE）直接结合的LDL，这些未经氧化修饰而仅经一般化学修饰的LDL称为衍化的LDL。不同于衍化的LDL，Ox-LDL 的生理学独特性表现在：1）在细胞生理功能影响上，Ox-LDL可诱发细胞毒性作用，影响花生四烯酸的代谢，抑制酯化作用等，但衍化的LDL无上述效应；2）Ox-LDL消耗LDL内源性抗氧化物质，使LDL上的含量下降，而MDA-LDL无上述效应；3）氧化修饰涉及脂质过氧化反应，LDL中的PUFAs被氧化。MDA对LDL修饰，是直接和ApoB-100结合成希夫氏碱，脂质过氧化反应轻微；4）氧化LDL在氧化程度低时，ApoB降解；在氧化程度高时，ApoB又可发生再聚合。MDA对LDL的修饰，ApoB无降解、聚合反应发生；5）Ox-LDL 产生的荧光峰波长为430nm，而MDA -LDL的荧光峰波长为460nm。Ox-LDL不经LDL受体代谢，由清道夫受体识别、结合、内吞饮入细胞并丧失正常的代谢途径，引起细胞内脂质沉积，泡沫样变。

LDL氧化修饰的方式有很多种，常见的有：1）细胞介导的LDL氧化修饰，又称为生物氧化修饰的LDL。如内皮细胞，巨噬细胞，单核细胞都具有此功能；2）过度金属离子介导的LDL氧化修饰，如Ca2+，Fe2+等；还有其他形式的氧化修饰，包括物理方法如紫外线，或过氧化物酶催化。

本品为红色荧光标记的氧化型人源低密度脂蛋白（Human DiI-Ox-LDL），是标记荧光探针DiI（1,1-dioctadecyl-3,3,3,3- tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate）的Ox-LDL，可以标记血管内皮细胞和巨噬细胞，可用来鉴定并分选这些细胞，以及用来研究不同细胞系对修饰化LDL的内吞作用。我司提供的DiI-Ox-LDL，每个批次均经过牛大动脉内皮细胞和小鼠巨噬细胞的标记检测来评估产品的标记特异性，从而保证结果的一致性。

浓度：0.8-3.0 mg/ml

外观：乳状液体

缓冲液组分（Buffer Components）：0.02 mM EDTA in PBS, pH 7.4
储存条件：4℃，无菌避光，有效期6周

实验步骤：

(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可！固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀

(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次

(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)

(7)10,000rpm,4℃离心20min

(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃离心20 min

(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC处理水溶解

(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)

操作步骤:

1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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