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产品名称:
小鼠端粒酶活性实时定量PCR法检测试剂盒
型号:
CS-01F98119
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小鼠端粒酶活性实时定量PCR法检测试剂盒现货供应,价格实惠。
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一、概述:

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小鼠端粒酶活性实时定量PCR法检测试剂盒

 

20T|50T

CS-01F98119

端粒是真核生物染色体末端特殊的DNA-蛋白结构,含多个重复序列(5-TTAGGG-3’),端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体,是由RNA 和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶,其可以利用自身的RNA 模板合成末端DNA,并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失,从而使细胞获得增殖能力。

端粒酶蛋白催化亚基(TERT TRT)具有反转录酶的主要特征,其表达在正常细胞中受到抑制,研究表明,TERTTRT 的表达与端粒酶活性的表达一致,与端粒酶的活化程度密切相关。Wisman 等在人卵巢癌中利用逆转录PCR 检测hTERT mRNA 的表达,并采用TRAP 法检测端粒酶活性,结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理,我司实时荧光定量PCR 端粒酶检测试剂盒通过检测TERT mRNA 表达水平来间接反应端粒酶的活性。

实时荧光定量PCRSYBR Green Real-time PCR)方法以其的快速性及定量性被广泛应用于科研领域,使用本试剂盒可以准确简便地进行mRNA 的表达分析。试剂盒采用SYBR Green qPCR Master Mix 为荧光实时定量PCR Two-Step 荧光实时定量PCR 设计的优反应体系,并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因TERT 引物,简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix 含有Maxima Hot Start Taq DNA 聚合酶、dNTPS、进行优化处理的PCR 反应缓冲液以及SYBR Green 染料。使用Hot Start Taq DNA 聚合酶,为PCR 反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性,能够检测低至10 个拷贝的目的基因。
本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对细胞基因进行准确定量、检测,重复性好,可信度高。只需加入样品DNA 模板,反应即可进行。

实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀  
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

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