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小分子蛋白电泳试剂盒 | Small molecule protein electrophoresis Kit | 10次 | CS-01F98047 |
本试剂盒含有小分子蛋白电泳(多肽电泳)全套试剂,可以用来检测1-20kd的多肽大小。本试剂盒可配制至少10块常规大小的PAGE胶(8×10cm)。
试剂盒特点: 1 适用范围广:2×多肽电泳缓冲液和2×PAA溶液中不含有SDS,适用于多肽的变性和非变性电泳。 2 分辨率高:凝胶缓冲液独特配方,可以有效分离1-5kD多肽。 3 稳定性高:凝胶缓冲液pH为中性,存放时间长。 4 使用方便:配制凝胶时只需1:1混合2×凝胶缓冲液和2×PAA溶液,加上APS和TEMED即可配制凝胶。 使用方法: 1、将电泳后的PAGE胶取下放入塑料容器中,加入适量染色液(以刚刚覆盖过胶面为适),条带1-2分钟即可见。 2、摇床上常温摇动10-15分钟。 3、观察结果。 注意事项: 1、使用方法中的各种参数仅针对面积8×10cm或10×10cm,厚度0.75mm和1mm的凝胶,如果使用更大面积或更厚的凝胶,请加入更多的染色液并延长染色的时间。 2、常规染色所需的漂洗,固定,脱色步骤都无必要。 3、本染色液可以重复利用1-2次,敏感性会有轻微下降,请延长染色时间。 4、本染色液有轻微腐蚀性,请带手套操作。使用后,请盖好瓶盖,常温密封保存。 储存条件:4℃,有效期一年。 |
实验步骤:
(1)实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀
(3)65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
(4)加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5)::异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等体积的:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或过夜)
(7)10,000rpm,4℃离心20min
(8)弃上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::异戊醇(25:24:1)抽提两次,:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃离心20 min
(12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC处理水溶解
(14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
操作步骤:
1. 匀浆处理:a.组织 将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。
b.单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞,每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml,用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定,不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。
c.细胞悬液 离心收集细胞,每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol,反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。产品仅用于科研
2.将匀浆样品在室温(15-30℃)放置5分钟,使核酸蛋白复合物完全分离。
3.可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
6. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
7. 把水相转移到新管中,如要分离DNA和蛋白质可保留有机相,进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟。
8. 2-8℃10000×g离心10分钟,离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。